实验 硫酸铵分级沉淀分离苯丙氨酸解氨酶.ppt

实验（一）硫酸铵分级沉淀分离苯丙氨酸解氨酶（8学时）,一、实验背景,了解硫酸铵沉淀蛋白质的原理；掌握分级沉淀分离酶的基本操作和方法,二、实验原理,盐析：在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析，因为中性盐在水中解离时，能夺走蛋白质胶粒表面的水分子，破坏水膜结构；同时中性盐解离后形成的带电离子能中和蛋白质表面的电荷，这两种作用使溶液中蛋白质沉淀析出。,分级沉淀：不同盐浓度下各种蛋白质的溶解度是不同的，因此调节溶液的盐浓度可使各种蛋白质先后沉淀出来，或者使需要的酶与其它杂质蛋白分开，达到提纯目的，这就是分级沉淀法。硫酸铵沉淀一般在蛋白纯化的步骤中前期用，它简便且重复性好，但纯化倍数不高。分级沉淀中需加的固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液的量，可从硫酸铵饱和度量表中查得。,苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine:ammonialyase，简称PAL）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物的正常生长发育和抵御病菌侵害的过程中起重要作用。PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，产物反式肉桂酸在波长290nm处有最大吸收值。在反应系统中如果酶的加入量适当，反式肉桂酸的生成速率即A290升高的速率可在几小时内保持不变，因此，可通过测定A290升高的速率来测定PAL的活力。规定1小时内A290增加0.01为PAL的一个活力单位。,三、实验试剂,0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（PH8.7）酶提取液0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（内含1mmol/LEDTA、20mmol/L-巯基乙醇）。取100ml0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（PH8.7）,加入0.037克EDTA钠盐，混匀，临用前再加入0.137ml-巯基乙醇，混匀；0.6mmol/LL-Phe溶液。称取L-Phe9.912毫克溶于100ml蒸馏水中；6NHCl溶液固体（NH4）2SO4,四、实验步骤,1、酶液提取：（1）取小麦幼苗（发芽56天）2克，用剪刀剪成小段后，立即放入有10ml酶提取液的研钵中，于冰浴上研磨匀浆，匀浆结束前，再加入10ml酶提取液研磨混匀（2）将已匀浆的酶液，用三层纱布过滤、挤干。滤液转入离心管，平衡后，于10,000g下冷冻离心30min；（3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积V1，放置冰浴中备用。,实验步骤,2.硫酸铵分级沉淀酶蛋白：（1）从酶粗提液中吸取出0.5ml，以作后面活力测定等用，根据实际体积和硫酸铵饱和度用量表，算出达到40%饱和度实际应加入酶液中的硫酸铵量，并称取该量的硫酸铵；,（2）将酶液到入烧杯内，烧杯置于冰浴中，然后在边缓慢搅拌下缓慢加入称好的固体硫酸铵（不能有大颗粒，放在研钵中研碎），待全部硫酸铵加入后，再缓慢搅拌20min；,实验步骤,2.硫酸铵分级沉淀酶蛋白：（3）将上述溶液到入离心管，3,000g下冷冻离心30min，倒上清液于烧杯内，保留沉淀，记为沉淀1；（4）根据硫酸铵饱和度用量表中，查出从40%到75%饱和度所需硫酸铵用量，算出并称取实际应加的硫酸铵量；（5）按上述（2）、（3）步同法处理，离心后，倒出上清液，保留沉淀，记为沉淀2。,实验步骤,3.酶活力测定：（1）将沉淀1和沉淀2分别溶于1ml酶抽提液中，待沉淀全部溶解后，量出其体积V2、V3，记为沉淀液1和2；（2）分别从沉淀液1和2中吸出0.2ml加入另外二个试管内，然后用酶提取液分别将其稀释成1ml，记为稀释沉淀液1和2；（3）取试管7支，按下列编号并加入各试剂：,实验步骤,3.酶活力测定：（4）以上试管放入恒温水浴（40）中保温60min后，立即加入0.2ml6NHCl，混匀，终止反应；（5）于波长290nm处，以0号管溶液调零，分别记录测得的各管A290值。酶活单位定义：规定1小时内A290增加0.01为PAL的