第四章酶学分析技术PPT课件

.,1,第四章,酶学分析技术,.,2,酶（enzyme）的本质：,高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性,酶的应用：,由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂,酶的特点：,酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临床诊断和疗效判断,.,3,主要内容：,酶活性测定的基本知识酶活性单位的计算与校准酶活性的测定代谢物的酶法检测同工酶测定,.,4,掌握酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。熟悉酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。了解同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的校准、工具酶的应用。,教学要求：,.,5,第一节酶活性测定的基本知识,酶测定,绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法,E,E,.,6,简介内容：,一、酶活性二、酶活性单位与酶活性浓度三、酶促反应进程四、酶促反应动力学,.,7,一、酶活性,定义：酶活性（enzymeactivity）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。,表示方法：,或,式中v：反应速率，P：产物浓度，t：时间，S：底物浓度。,.,8,二、酶活性单位与酶活性浓度,（一）酶活性单位,定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。,表示方法：,惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间）国际单位IU（mol/min）Katal单位（mol/s）,.,9,1惯用单位：,20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位,ALP的金氏单位（King）氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）,特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。,卡门氏单位：1.0ml血清在25，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.8210-4molNADH为一个卡门氏单位,举例：,金氏单位：100ml血清ALP在37与底物作用15min，产生1mg酚。,.,10,2.国际单位IU（mol/min）,定义：在规定条件下（25及其他最适条件），每min催化1mol底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1mol/min。,IFCC,2001年37,3Katal单位,定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的酶量。1Katal1mol/s。,IU与Katal单位的关系：1katal=60106IU，1IU=16.67nkatal,.,11,（二）酶活性浓度,酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.,.,12,三、酶促反应进程,以产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线）,.,13,（一）延滞期（lagphase、延迟期）,特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟,t1t2时间t图5-1酶促反应进程曲线,吸光度A,线性期,非线性期,R1,R2,延滞期,孵育期,延滞期,.,14,（二）线性期,此阶段酶促反应速率基本保持恒定；对底物而言，为反应速率与底物浓度S的零次方成正比的零级反应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比；,此时底物的消耗量小于5%，反应速率为反应初速率。酶活性浓度越高，线性期就越短,线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受的程度。线性度=前半段A/min后半段A/min/（前半段A/min后半段A/min）/2100线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于15，否则判为非线性,特点：可代表酶促反应速度,.,15,（三）非线性期（偏离线性期、平坦期）,进入非线性期的原因：,反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。,特点：,若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度S的一次方成正比，为一级反应。,.,16,四、酶促反应动力学,研究内容：,研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、酶活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学,指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性或代谢物浓度。,研究意义:,.,17,（一）酶促反应,酶促反应式,米氏方程：,K4,.,18,（二）Km的含义与意义,1Km的含义:,当Km=S时，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。,2Km的意义,Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关反映酶对底物亲和力的大小选择酶的最适底物或天然底物计算不同底物浓度时的反应程度鉴别酶的种类判断可逆反应的速率判断酶偶联反应的限速反应计算工具酶的用量,.,19,（三）Vmax的含义,定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。,应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值。,计算公式为：,(单位是s-1),计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）,.,20,（四）Km和Vmax的测定,1、双倒数作图法：,纵轴截距为,斜率为,横轴截距为,Linweaver-Burk作图法,.,21,利用此图还可用于判断可逆性抑制反应的性质：,如竞争性抑制：,.,22,第二节酶活性单位的计算与校准,一、酶活性单位的计算（掌握）二、酶活性单位的校准（了解）,内容简介：,.,23,一、酶活性单位的计算,（一）通用公式,前提条件：必须保证启始底物量充足（SKm），使酶促反应处于零级反应期即线性期，反应初速率等于最大反应速率，从而使酶发挥最大活性mu与酶活性正相关，而与启始底物量无关,.,24,注释：式中U：酶活性单位数，m0：规定的产物生成量或底物消耗量，V0：规定的样本体积，t0：规定的反应时间，mu：实际产物生成量或底物消耗量，Vu：实际样本体积，tu：实际反应时间,实测的酶活性大小,规定的酶活性单位,(5.1),.,25,（二）采用酶活性惯用单位的计算公式,常用设立标准管（校准管）的对比法（简称对比法、比较法）测量吸光度的变化求出。特点：校准管并不含酶常用定时法（固定时间法）求A,A=A终止点-A空白也可用不设校准管的比尔定律摩尔吸光系数法求出,mu的确定方法：,.,26,惯用单位的计算公式：,测定产物生成类的计算公式,测定底物消耗类的计算公式,根据测定对象,.,27,1、测定产物生成类的计算公式,mu为生成的产物量，反应后从无到有，其存在量即生成量，与酶活性成正比,常规计算方法和公式：设立一个校准管，与测定管同步操作。,特点：,Cc=Cu,Au：测定管吸光度，Ac：校准管吸光度，Cc：校准物摩尔浓度，Vc：校准物体积,Mu=CuVc,（5.2）,.,28,校准曲线法和公式：,设立多个校准管制备A-U校准曲线，测出A值后查出U值,其中，k1和Ac都是变量，随不同的Vc而呈比例变化。上相当于直线方程Y=bX。图5-3纵坐标上某一点Au(=Ac)相对应的横坐标U值为k1。各校准管所相当的酶活性单位数k1可由其不同的Vc代入公式算出。,（）,(5.3),.,29,测定管：血清0.1ml加底物液等后于37水浴15min，再加显色液显色。同时，设立除先不加血清、其它步骤相同的空白管（在反应最后加血清），510nm处以空白管调零测出Au。校准管：以校准曲线中第2管为例。取0.05mg/ml的酚校准液0.4ml，加显色液等至总体积与测定管相等，用蒸馏水替代酚校准液、其它步骤相同的空白管调零，510nm处测出Ac。【计算】由式5.2有：,可见，第2管相当于酶活性单位为：20金氏单位/100ml血清，常简写为20金氏单位。,【单位定义】1金氏单位：100ml血清ALP在37与底物作用15min，产生1mg酚。,【操作】,例:金氏法测定血清ALP。,.,30,2测定底物消耗类的计算公式,mu为消耗的底物量，反应后从多到少在测定底物消耗类时，将不加样本不加底物而加蒸馏水、其他操作与测定管相同的操作管称为空白管；将不加样本而加蒸馏水、其他操作与测定管相同的操作管称为“对比”校准管（校准管）。空白管不含有底物。“对比”校准管与测定管反应前底物量相同。,特点：,单一校准管即“对比”校准管时的测定：因产物生成量与底物消耗量相等，将式5.2中代表产物生成量的Au换成代表底物消耗量的Ac-Au后有：,计算方法和公式：,（5.4）,.,31,例：碘色法测定血清淀粉酶（AMS）,【单位定义】1惯用单位：100ml血清AMS在3715min，水解5mg淀粉。,【操作】测定管：稀释10倍后的血清0.2ml中加0.4g/L的淀粉溶液1ml37水浴7.5min后显色。校准管(“对比”校准管)：用蒸馏水替代血清，其它步骤相同。反应完成后，660nm处以蒸馏水调零，分别测出Au、Ac。【计算】由式5.4有：,.,32,（三）采用酶活性国际单位的计算公式,1用微摩尔吸光系数（）表示的国际单位计算公式,摩尔吸光系数是表示吸光度与摩尔浓度（mol/L）、光径（cm）之间关系的一个法定计量单位.,摩尔吸光系数微摩尔吸光系数毫摩尔吸光系数,.,33,在连续监测法测定酶活性时，tu为酶促反应曲线线性期内时间变化值（亦可表示为tu），Au为线性期内测定管吸光度变化值,上式中：摩尔吸光系数，Cu：样本摩尔浓度（原始浓度），l：比色杯光径。注意Cu/nu为比色杯中的样本摩尔浓度（比色浓度）。,根据酶活性国际单位的定义：m0=1mol，t0=1min。常取规定样本体积V0=1L。相应地，tu计量单位为min，变为的Lmol-1cm-1，l为cm，则用微摩尔吸光系数（）表示的国际单位计算公式由上式可简化为：,(5.5),.,34,另外一种推导方式,将比尔定律Au=Cul/nu两边同时除以tu，结合样本稀释倍数展开后得到,.,35,0.2ml样本中加入底物液于3715min，终止反应后总体积为5.2ml。405nm处以空白管调零，1cm比色杯中测Au。已知对硝基酚在该条件下的为18380Lmol-1cm-1。,例:对硝基酚比色法测-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）。,【计算】由式5.7有,.,36,2用毫摩尔吸光系数（m）、摩尔吸光系数（）表示的国际单位计算公式,在吸光系数的数值关系上，以340nm处NADH（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型辅酶）在一定条件下的吸光系数为例：=6.22103Lmol-1cm-1m=6.22Lmmol-1cm-1=6.2210-3Lmol-1cm-1可见，m值=103值，值=106值，各代入式5.5后有：,（5.6）,（5.7）,（5.8）,.,37,3计算因数与测定产物生成类、底物消耗类的吸光度变化方向的关系,式5.5、式5.6、式5.7中Au/tu以外的部分都相等，称为计算因数Factor值（简称F值，或K值）：,（5.9）,由式5.9展开后可见，F值的单位是mol/L。不作校准时可采用试剂盒厂家给定的F值.,.,38,4国际单位间无可比性国际单位数相同的不同酶并不表示酶含量相同，因为其具体反应条件不尽相同，酶的激活与抑制状态也不相同，故国际单位之间无可比性。,一般用分光光度法测定酶活性，也可用荧光法测酶活性。荧光法测定酶活性的计算式与分光光度法计算式相似，仅将式中的吸光度A换成荧光强度F即可。,（四）katal单位与国际单位间的关系式据定义，1katal=1mol/s=106mol/(1/60min)=60106mol/min=60106IU1nkatal=0.06IU1IU=16.67nkatal,（五）荧光法测定酶活性单位的计算公式,.,39,二、酶活性单位的校准(了解),两种方式：一是用实际测定的摩尔吸光系数进行校准；二是用酶校准物（calibrator，校准品）来校准。,速率法测酶活性时，需要用实际测定的来计算真实的K值：将已知浓度的生色物如NADPH（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶）、对硝基苯酚等，或底物如葡萄糖等作为样本进行酶活性测定，测出吸光度变化值后计算出真实的K值，再代入连续监测法公式可以比较准确地计算出样本酶活性含量。,用实际测定的摩尔吸光系数进行校准:,.,40,第三节酶活性的测定,测定方法分类：,按照仪器检测方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。,按照反应时间分类；分为定时法、连续监测法和平衡法。,按照检测对象分类：分为直接法和间接法。,.,41,一、按照反应时间分类的酶活性测定方法,（一）定时法,原理：定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1t2）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。,特点：优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2）是否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。,定时法与两点法、终点法的区别,.,42,（二）连续监测法,原理：连续监测法是指在多个时间点连续测定产物（或底物）在线性期内的生成量（或消耗量）即零级反应速率以测定酶活性的方法，又称速率法、零级反应速率法、斜率法。,该方法是在一定的反应时间区段内（至少9120s）每隔一定时间（常为230s）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少4点），然后对吸光度数据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位时间内的反应速率A/min，最后据式5.7等计算出酶活性。,（5.7）,.,43,.,44,特点：与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应；连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物）或产物量的变化，因此，在测定原理上，可以选择紫外吸收法或生色原显色法；要求能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要求；测定结果常较定时法高，因为在酶促反应初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小，所以反应后期的吸光度等检测信号就比定时法要高且真实，因而测定结果也较定时法准确。,.,45,常用指示酶及其指示反应,1脱氢酶,用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它们催化下列反应：,P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+,可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定,应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。,.,46,2过氧化物酶,POD可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：,2H2O2+4-AAP+酚醌类化合物（红色）+4H2O,Trinder反应：,应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通过Trinder反应加以测定。,POD,.,47,（一）直接法,指直接测定酶促反应产物或底物的理化指标以测定酶活性的方法。,测定NAD（P）H的方法测定人工合成的色素原底物的方法测定耗氧量的方法测定pH改变的方法等,二、按照检测对象分类的酶活性测定方法,.,48,1测定NAD（P）H的方法原理：监测340nm吸光度的变化可以反映NAD（P）H量的变化，其变化与待测酶的含量正相关。对象：以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类。例如LD、G-6-PD、GLDH等。,.,49,2测定人工合成的色素原底物的方法,原理：一些水解酶类或转移酶类通过酶