重组体的筛选和鉴定PPT课件

1,.,2,.,8重组体的筛选和鉴定,筛选（Screening）遗传表型（phenotype）：是生物体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。,3,.,本章教学目的和要求：掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹（Westernblotting）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道基因筛选法。重点：常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免疫吸附测定（ELISA）难点：免疫印迹（WesternBlotting）法的原理,4,.,转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。非转化子：未接纳载体或重组分子的转化细胞。重组子：含有重组DNA分子的转化子。非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。期望重组子：含有目的基因的重组子。非期望重组子：不含有目的基因的重组子。,5,.,1抗药性标记及其插入失活选择法,pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。,一、利用载体提供的表型特征筛选重组体,原理：,8.1遗传学检测法,6,.,pBR322,.,7,外源DNA,pBR3224363,PstI酶切,PstI酶切,黏性末端,黏性末端,连接酶,重组子(ampstetr)空载体(amprtetr)插入子(ampstets),野生型的E.coli(ampstets),导入,涂布在含Tc的平板上,重组子转化子(ampstetr)空载体转化子(amprtetr),影印在含Ap的平板上,空载体转化子(amprtetr),因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应。,对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。,.,8,9,.,（1）四环素抗性基因Tetr：,（2）氨苄青霉素抗性基因Ampr：,pBR322抗菌素标记选择,产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（3）环丝氨酸：,10,.,选择过程：,如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。,Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（1）四环素抗性插入失活,11,.,无环丝氨酸培养基,12,.,氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。,13,.,14,.,2.蓝白斑筛选法,-半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,+,+,深蓝色,原理：,载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。,15,.,假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏肽）。,选择过程,16,.,-半乳糖苷酶显色反应筛选法,17,.,-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。,18,.,蓝白菌落,筛选白色菌落,19,.,3.噬菌斑筛选法,20,.,噬菌斑(plaque),噬菌斑是指在宿主细菌的菌苔上，噬菌体使菌体裂解而形成的空斑。,21,.,筛选植物转化细胞常用的报告基因,报告基因（reportergene）：系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。,4.载体提供选择动植物转化细胞常用的标记基因,22,.,（1）大肠杆菌的-D-葡萄糖苷酸酶（-D-glucuronidase，GUS）；（2）细菌和萤火虫的荧光素酶（luciferase）；（3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因（GreenFluorescentProtein）。,报道基因（reportergene),（4）其它,23,.,几种报道基因的作用原理,4-甲-D-葡萄糖苷酸,荧光产物,GUS,GFP,紫外光照,发绿色荧光,5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖醛酸,蓝色水解产物,GUS,24,.,FirefliesemitlightcatalyzedbyluciferasewithATP,25,.,转入萤火虫的luciferase的烟草,26,.,GFP-Kac的狗,GFP老鼠,GFPAlba發青綠光芒的兔子,27,.,新霉素磷酸转移酶基因（NPT）抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动植物转化子的标记基因。,28,.,-葡萄糖酸酶基因（GUS）,GUS的基因产物-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化4-甲基伞形花酮-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选含GUS基因的转化子。由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。尤其是GUS基因的3端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。,29,.,萤火虫荧光素酶基因（LUC）,LUC表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，Luc是一种理想的报告基因。,30,.,抗除草剂bar基因,bar基因编码磷化乙酰转移酶（PAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPT）成分的除草剂具有抗性。,31,.,冠瘿碱合成酶基因,主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因两类，存在于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA区段。冠瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染色，方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基因细胞的筛选。冠瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。,32,.,在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(Npt)基因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。常用的标记基因还有：-胸腺核苷激酶基因（TK）-二氢叶酸还原酶基因（DHFR）-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（XGPRT）,筛选哺乳动物转基因细胞常用的报告基因,33,.,真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。,二氢叶酸,四氢叶酸,二氢叶酸还原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）,胸苷激酶（thymidinekinase,tk）,（1）TK选择原理,四氢叶酸的必要性,DHFR,34,.,胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）等的表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞，导入含有这些基因的外源DNA，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加核苷酸的培养基中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。,35,.,利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,一、原理：,二、利用插入序列提供的表型特征筛选,1.弥补缺陷,his-,his+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,36,.,小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含DHFR的克隆才能生长,例：,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,2.增加新性状,37,.,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,一、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,8.2DNA电泳检测法,分子量Marker,载体,重组克隆,38,.,二、酶切电泳筛选法-物理检测法,1.原理：,根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。,或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。,39,.,40,.,A,B,A或B,41,.,三、PCR扩增检测法,1.原理,PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。,2.过程,（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）,（2）用外源DNA插入片断引物作PCR,（3）电泳PCR产物,（4）检查是否有PCR产物,（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致,42,.,1.核酸杂交,8.3核酸分子杂交检测,一、原理：,重组克隆与探针杂交,3.识别标记,32P或125I。,（1）放射性同位素,2.检测用的探针,与外源DNA插入片断互补的序列,（2）非放射性标记,荧光素、生物素地高辛,43,.,二、核酸杂交检测方法,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,1.Southernblotting,从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。,只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。,.,44,SouthernBlotting,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,.,45,Southernblot,探针,.,46,.,47,48,.,（1）原位杂交筛选,特点：,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,.,49,原位杂交筛选DNA重组体图解,复印至硝酸纤维素膜上,用NaOH菌体裂解DNA变性,杂交,放射自显影,32P-cDNA,与放射性cDNA杂交的菌落的斑点,细菌菌落,单链DNA结合到膜上,.,50,51,.,（2）R-环检测法,DNA-RNA杂交,1）原理：,2）选择过程,在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。,用外源基因的mRNA与重组载体杂交。,52,.,缺点：需要电镜！,53,.,2.Northernblotting,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。,54,.,NorthernBlotting,55,.,WesternBlotting,.,56,Southern和Western印迹法,DNAfrangment,Electrophoresis,TransferofDNAbyblotting,32P-labledDNAprobe,Autoradiography,Agarrosegel,Autoradiogram,Nitrocellulosesheet,Autoradiogram,Polymersheet,SDS-Polyacrylamidegel,Transferprotein,Addradiolabledspesficantibody,Washtoremoveunboudantibody,Proteinbanddetectedbyspecificantibody,Autoradiography,57,.,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,一、放射免疫测定法,8.4免疫化学类检测法,1.抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,58,.,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,125I标记的二抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因产物蛋白,一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,125I标记的二抗结合蛋白,125I标记的二抗,59,.,2.放射免疫测定法过程,细菌菌落溶解，释放出抗原蛋白质,60,.,61,.,免疫化学法检测克隆在载体pUC8上的小鸡原肌球蛋白基因,62,.,滤膜,抗体溶液,放射性标记抗体检测法的操作程序,聚乙烯薄膜,培养皿及菌落,放射性标记抗体检测法的操作程序,63,.,3.Broome-Gilbert双定位检测法,质粒基因A,插入基因B,表达,质粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,检测融合蛋白,既检测外源基因产物又检测载体基因产物,64,.,固相支持滤膜,抗A抗体,125I标记的抗B抗体,质粒蛋白A,外源蛋白B,质粒蛋白A,外源蛋白B,固相支持滤膜,抗A抗体,发光，底片曝光,65,.,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”(白色圆圈)。,1.原理,抗原抗体凝集反应。,检测分泌型产物。,2.方法,66,.,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,67,.,三、酶联免疫吸附测定（ELISA）,Enzyme-linkedimmunosorbantassay,1.原理：,一抗（primaryantibody）:与目标分子的特异结合。二抗（secondaryantibody）：与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,68,.,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,19,69,.,2.ELISA检测的一般步骤,（1）固定样品,将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。,孔底,70,.,加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,（2）一抗结合,一抗,71,.