感受态细胞的制备及重组质粒的转化PPT课件

1,感受态细胞的制备及重组质粒的转化,experimentsofmolecularbiology,2,重组DNA技术,3,重组DNA技术的基本工具,“分子运输车”,4,受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许含有外源DNA的载体分子通过的细胞，即感受态细胞(competentcell)。,感受态细胞(competentcell),5,是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。,转化是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。,转化（transformation）,6,化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克处理将载体DNA分子导入受体细胞。电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,转化的方法,7,转化原理（CaCl2法）,将处于对数生长期的细菌置入0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域；此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。,8,转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。,CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15-30的无菌甘油于-70保存(半年)。,9,影响转化效率的因素,10,实验原理,本实验以E.coliJM109菌株为受体细胞，并用CaCl2处理使其处于感受态，然后与pMD19-T-X重组质粒共保温，实现转化。由于重组质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pMD19-T-X重组质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。能在含Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了重组质粒。,11,抗Amp,宿主细菌,含Amp培养基,12,实验仪器、材料,1超净工作台2高速离心机3恒温摇床4恒温培养箱5恒温水浴锅6制冰机7移液枪,13,实验材料、试剂,1大肠杆菌JM109菌株2重组质粒31.5mL离心管，Tip头4试管、培养皿,1LB液体培养基2含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50gmL）3氨苄青霉素贮存液（浓度50mgmL）40.1mol/LCaCl2溶液,14,实验安排,1,受体菌的培养,感受态细胞的制备,2,3,质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化,实验安排,15,一、受体菌的培养,从新活化的E.coliJM109平板上挑取一单菌落，接种于3mlLB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。（已做）将该菌悬液以1:50转接于50mlLB液体培养基中，37250rpm振荡扩大培养约1-2h，当OD600nm值为0.30.5时，取出置冰浴。,16,1、取1mL菌液于1只1.5mL离心管中，置冰浴5min，10000rpm离心1min（每班需做对照管至少1管）（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；2、弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸上，每管加入0.5mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2悬浮细菌，置冰浴10min；3、4000rpm离心10min，弃上清；4、每管加入50L冰预冷的0.1mol/LCaCl2悬浮细菌，冰上放置，即为感受态细胞。,二、感受态细胞的制备,17,1、实验管加5L重组质粒DNA，对照管加5L灭菌水，轻轻混匀，置冰浴20min；2、42水浴热应激90s（精确计时），迅速放回冰浴，冷却5min后加入1mLLB液体培养基（不含Amp），37250rpm振荡培养约1h；3、取50L菌液均匀涂布在LB琼脂平板上（含50g/mLAmp，事先做好），37培养过夜（12-16h）后观察结果。,三、质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化,切记：玻璃棒经酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫！,18,对照组：,以同体积的灭菌双蒸水代替重组质粒，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素（Amp）的LB琼脂平板上应没有菌落出现。,本次实验组预期结果：,19,感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速（所有操作均应在冰上进行）。为减少对细胞的机械损伤，操作时动作一定要轻柔。菌液涂布操作时应避免反复来回涂布，过多的