真核表达系统

1,.,真核表达系统,酵母丝状真菌昆虫哺乳动物细胞转基因动物植物反应器,2,.,酵母表达系统的优缺点,遗传背景清楚（基因组是大肠杆菌的3.5倍）增殖快（90min/代），培养容易，产量较高易于研究突变与基因功能，如构建酵母人工染色体等可以进行转录和翻译后修饰加工提纯工艺复杂，成本高，制品纯度达不到要求，制品免疫原性差，接种剂量大,3,.,酵母载体的基本结构,DNA复制起始区：2质粒和自主复制序列选择标记：营养缺陷型和显性选择（抗药）整合介导区：同源重组，决定整合位置和拷贝数有丝分裂稳定区：帮助载体平均分配表达盒转录启动子终止子分泌信号序列,4,.,酵母表达系统中载体的种类,按载体在酵母中的复制形式分为：YIp：酵母整合型载体YRp：酵母自主复制型载体YCp：酵母含着丝粒片段载体YEp：酵母附加体型载体YAC：酵母人工染色体,5,.,昆虫表达系统,杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子表达系统杆状病毒表达系统（BEVS）家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的600多种昆虫克隆基因方法：转移载体共转染同源重组空斑筛选纯化重组病毒,6,.,杆状病毒表达系统优点,容量大：能插入12kb的外源基因高表达：polh基因启动子是目前所知的最强的真核启动子；产物对宿主影响小；产物可结晶高效：可同时表达多个基因安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性具加工修饰功能：昆虫细胞较高等家蚕易饲养,.,7,哺乳动物细胞表达表达系统,常用宿主细胞哺乳动物细胞常用载体真核细胞表达元件哺乳动物基因转移的遗传标记基因表达的检测方法,8,.,哺乳动物细胞表达的优点,重组DNA易转染，遗传稳定，可重复识别和去除内含子进行翻译后修饰磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、高级结构的正确折叠产品的构型正确率高，可被改造成类人体源性，免疫源性好可分泌至培养基，提纯工艺简单，成本低可用于基因治疗,9,.,常用宿主细胞,10,.,真核细胞表达元件,原核DNA序列启动子增强子拼接信号终止子和多聚腺苷化信号筛选标记动物病毒基因序列,11,.,原核DNA序列,原核复制子抗生素抗性基因多克隆位点,12,.,启动子,真核启动子：RNA聚合酶（）结合并起动转录的DNA序列一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长7-30bp核心启动子元件：RNA聚合酶起始转录所必需的最小DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处的TATA盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录上游启动子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。与相应的蛋白因子结合改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件组成，其位置也不相同，即不同的基因表达分别有不同的调控,13,.,哺乳类RNA聚合酶启动子中常见的元件,14,.,常用启动子,Rous肉瘤启动子（RSV）巨细胞病毒启动子（CMV）SV40启动子,15,.,增强子,增强子：是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物、甚至在原核生物中都发现了增强子增强子通常占100-200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，其基本核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在,16,.,增强子的作用特点,提高同一链上基因转录效率，可远距离起作用，通常距离1-4kb、但远至30kb仍能发挥作用，在基因的上游或下游都能起作用与其序列的正反方向无关要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的,17,.,常用增强子,LTR：Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列人类巨细胞病毒增强子SV40病毒增强子,18,.,终止信号和polyA信号,真核基因转录的终止信号与机制还不明确polyA增加mRNA的的稳定性多聚腺苷化所需的两种序列位于polyA下游GU丰富区或U丰富区位于polyA上游11-30bp处的5-AAUAAASV40polyA信号,19,.,遗传性标记,胸苷激酶基因（tk）选择系统二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统新霉素抗性基因（neo）选择系统氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统,20,.,胸苷激酶（TK）基因选择系统,TK是核苷酸补救合成途径的一个关键酶内源性缺陷tk的宿主细胞小鼠LMTK细胞HAT选择法H：次黄嘌呤；补救合成三种核苷酸的原料A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成T：胸苷；补救合成dTTP的原料tk细胞的鉴别与获得：5-溴脱氧核糖尿苷（BUdR）筛选,21,.,二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系统,DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸筛选剂：叶酸类似物氨基喋呤或氨甲喋呤dhfr缺陷型细胞CHO细胞正常细胞可通过提高氨甲喋呤浓度筛选突变型dhfr基因的导入扩大筛选宿主细胞的范围,22,.,新霉素抗性基因选择系统,新霉素（neo）：即G418，一种氨基糖苷类抗生素，影响80S核糖体功能核蛋白质的合成新霉素抗性基因编码3-磷酸转移酶降解G418适用于所有的真核细胞,23,.,氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统,CAT：大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素乙酰化反应的蛋白质真核细胞缺乏CAT导入CAT可作为报告基因常用于瞬时表达研究,24,.,表位标记,表位：抗原决定簇即抗原分子于一特定抗体结合的化学基团，一般由少至几个氨基酸的多肽组成用于重组DNA技术的示踪、分析、纯化（亲和）优点用一种抗体可鉴别不同重组蛋白不影响蛋白功能有利于研究蛋白功能常用表位：6His；FLAG；LZ等,25,.,构建含表位的重组体,使用常用密码子注意克隆位点（限制性酶切位点）相符5端加上起始密码子ATG3端加上终止密码子可插入蛋白酶切位点基因，以利于产生天然蛋白其他常规构建载体的注意点,26,.,真核表达载体,质粒：真核表达元件、真核抗性病毒载体：改建后SV40病毒腺病毒反转录病毒痘苗病毒,27,.,病毒基因组的结构特点,病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成基因重叠即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位,形成一个功能单位或转录单元除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的,28,.,病毒载体优点,真核细胞可识别的启动子报告基因可持续复制（感染周期）部分载体可整合入基因组部分载体本身带有完整的复制及表达元件部分载体具有宿主细胞特异性识别受体假病毒颗粒,29,.,猿猴空泡病毒（SV40）,种属分类：乳多空病毒科多瘤病毒属双链共价闭合环状DNA（cccDNA），5243bp20面体立体对称结构，直径45nm以EcoRl内切酶切点作为0点分成100等分，Ori点是DNA双向复制的起绐点早期编码进程是逆时钟方向，在病毒DNA自制前，编码的蛋白质(大T、小T抗原)与诱发宿主细胞的转化有关晚期编码区进程为顺时钟方向，是在病毒DNA复制开始以后，编码的蛋白质为三种病毒壳体蛋白VP1、VP2和VP3，这些蛋白是病毒的结构蛋白，不参与细胞的转化过程,30,.,31,.,SV40感染细胞模式,感染形式：随宿主的不同产生的效应不同许可性细胞裂解性感染（猿猴细胞）非许可性细胞整合入染色体（啮齿动物细胞）半许可性细胞既不整合也不裂解（人细胞）,32,.,SV40载体类型,取代型重组病毒去掉晚期区一段DNA，外源基因可插入需辅助病毒感染可形成病毒颗粒重组病毒-质粒载体保留病毒复制相关序列插入细菌质粒序列，可在大肠杆菌种复制增殖不形成病毒颗粒,33,.,SV40及衍生载体的优点,可在多种细胞中表达基因组DNA、cDNA均可表达SV40的复制起始点广泛宿主范围的启动子多聚A信号DNA拼接供体和信号（剪接内含子）部分载体含有报告基因,34,.,感染宿主范围有限复制只能在猿猴细胞中载体DNA分子量小，容量小在用辅助病毒混合感染时，有野生化危险,SV40及衍生载体的缺点,35,.,36,.,痘苗病毒,双链DNA病毒180kb，编码200种左右的蛋白可独立的在细胞质中复制转录,37,.,痘苗病毒载体优越性,宿主范围广泛容量大插入的外源基因可达25kb瞬时表达无致癌性本身即需接种可作为重组活疫苗的载体,38,.,痘苗病毒载体的缺点,分子量大，操作较困难无剪接功能不能插入含内含子的基因外源基因必须插入非必需区,39,.,构建重组痘苗病毒流程,tk基因插入质粒tk基因内插入痘病毒早期启动子接上多克隆位点接上外源基因野毒株感染细胞导入重组载体同源重组含外源基因的tk基因取代筛选含外源基因的重组病毒感染敏感宿主细胞表达外源基因,40,.,腺病毒,Ad病毒颗粒的直径为70-90nm，呈20面体立体对称型，核心外层的壳体由252个壳粒亚单位组成双股线型DNA，DNA约占病毒重量的11-14%不同亚型Ad病毒的DNA的G+C%含量不同，与其致瘤性能强弱有关Ad2基因组的早期转录区有6个独立的区域:IA(EIA)、EIB、E2(E2A和E2B)、E3、E4Ad2基因组约长36kb，EIA和EIB与Ad2的启动和转化细胞密切有关腺病毒虽然分布广泛，其中某些亚型对动物具强致瘤性，但是从A组到E组，迄今尚未证明与人类肿瘤有病因学上的联系,41,.,腺病毒载体,容量较大：可插入7kb易培养、纯化复制与转录依赖与宿主聚合酶不整合释放壳体蛋白，引起免疫反应,42,.,基因的导入方法,光穿孔法：激光；悬浮细胞冲击波：活体局部的基因转移基因枪法：即微粒轰击；动物细胞，更适用于植物细胞穿孔法：脉冲电场；Cytomix缓冲液；70%细胞死亡时效率最高磷酸钙共沉淀法脂质体法：Lipofectin；阳离子抗体转染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反转录病毒感染法,43,.,表达产物的检测技术,Western印迹法免疫学方法抗原-抗体反应荧光显微镜法表位标记的抗体与直接抗体进行荧光标记免疫学方法,44,.,Western印迹法,蛋白样品制备SDS-PAGE（按分子量大小）电转移一抗（特异性）二抗显色敏感度：1-5ng,45,.,样品的制备,裂解细胞电泳加样缓冲液裂解细胞（煮沸5-10min）抽提细胞蛋白（超声）,46,.,SDS-PAGE,丙烯酰胺和N，N-亚甲双丙烯酰胺交联，形成一定孔径的分离介质，孔径大小由浓度决定，具有分子筛效应在不连续的缓冲系统，具有浓缩效应蛋白质本身的电荷效应SDS：阴离子去污剂，与蛋白质结合SDS浓度大于0.05%时，使样品中的蛋白质带同样密度的电荷电泳时使蛋白迁移只与分子量有关，且呈线性（对数分子量与迁移率），可测定分子量,47,.,电转移,支持介质：重氮苄氧甲基纸（DBP纸）、阴离子化尼龙膜、硝酸纤维素膜（NC）蛋白质带负电，向正极迁移凝胶考马斯亮兰染色，检查转移是否完全膜丽春红染色标记分子量位置,48,.,靶蛋白的免疫学检测,封闭非特异性结合位点，脱脂奶粉或血清白蛋白第一抗体：具有特异性，最好氏多抗或抗血清标记的第二抗体：同位素标记；碱性磷酸酶（AKP）标记；辣根过氧化物酶（HRP）标记注意封闭非特异性位点注意抗体浓度：尤其是一抗浓度,49,.,显色反应,AKP催化5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸与氮蓝四唑发生反应，产生深蓝色HRP催化3,3-二氨基联苯胺与H2O2反应产生棕色条带，