肿瘤细胞培养40579

.,1,肿瘤细胞的培养,安徽医科大学微生物学教研室,.,2,内容纲要,肿瘤细胞体外培养的重要性和应用体外培养肿瘤细胞的特征肿瘤细胞系的建立癌细胞系的建立转化细胞系的建立癌细胞系和转化细胞系的鉴定,.,3,一、肿瘤细胞体外培养的重要性和应用,肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、肿瘤细胞和癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。,.,4,1、肿瘤病因和发病机制的研究,体外试验证明了物理因素（如射线）、化学因素（化学致癌剂）及生物因素（致癌病毒、EB病毒、SV40和多发瘤病毒等），均能使正常细胞发生转化，致使正常细胞永生化或恶性化，为癌的诱发因素和环境提供了实验依据。环境因素或药物的致畸、致突变研究也可为该环境条件或药物的致癌性提供实验依据，因此细胞培养是癌的发生和发展研究的理想实验研究手段。,.,5,2、抗癌药物筛选方面的研究,不同的癌细胞对不同的化疗药物具有不同的敏感性。采用癌细胞体外培养方法，既可研究某种药物对不同癌细胞的敏感性，为药物抗癌敏感谱提供依据；同时又可采用某种癌细胞开展对不同药物，不同剂量的敏感性研究，以筛选出对该肿瘤最敏感的化疗药物和使用剂量，供人体治疗时参考。,.,6,3、癌基因和抑癌基因方面的研究,实验证明癌的发生和发展与癌基因（原癌基因）和抑癌基因两种基因的表达调控密切相关。体外细胞培养既利于测定癌基因及癌基因表达产物，又可以测定抑癌基因的表达水平。癌细胞的体外培养是定量研究癌基因和抑癌基因表达调控的理想工具。,.,7,4、癌细胞的诱导分化和逆转方面的研究,血癌往往是由低分化的幼稚细胞的单克隆恶性增生所引起，若将血癌的体细胞通过体外诱导分化，促使向终未细胞分化成为功能性血液细胞，这就可使血癌患者获得完全缓解或达到治愈的目的。这些试验只有采用细胞培养法才能在短期内观察到细胞的变化，动物试验很难判定药物的直接作用，因此细胞培养及癌的细胞诱导分化的细胞工程是进行抗癌研究、癌细胞的恶性逆转研究理想的实验诱导模型。,.,8,5、癌细胞的杀伤效应研究,抗癌的间接效应，往往是药物作用于机体免疫系统促使免疫细胞发生对肿瘤细胞的特异性和非特异性的免疫应答，如释放免疫调节因子（如IFN、IL-2等）或细胞毒因子（LT、TNF/），以及激活杀伤肿瘤的淋巴细胞发挥杀肿瘤效应。这种效应均可通过体外杀肿瘤细胞试验来证实，取同体淋巴细胞经体外培养后，并加入IL-2/IFN-等，能明显增强NK、TCL、LAK和TIL杀肿瘤活性。经扩增达一定数量后再回输给病人，其疗效明显。,.,9,二、体外培养肿瘤细胞的特征,肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增殖、遗传性状等方面都有显著的不同。,.,10,培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核浆比例大。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则。,1、形态,.,11,2、生长增殖（不受控增殖性）,失去接触抑制，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。失去锚着依赖性，可在琼脂、甲基纤维素等支撑物上生长。低血清要求，不依赖生长因子，因其可自分泌产生促增殖因子。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。,.,12,3、永生性,永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡。体外培养中的肿瘤细胞系（株）都表现有这种性状。永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控。从一些具有永生性而无恶性的细胞系，如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等细胞可以证明。,.,13,4、致瘤性,细胞接种同种动物或裸鼠后的致瘤性是客观反映细胞恶性程度的指标。具体做法是：1）收集培养的肿瘤细胞，用无血清培养液洗一遍；2）计数后将0.2ml含21062107个细胞的细胞悬液注射到动物皮下。约一个月左右（最短在3天后），可见注射局部有肿瘤出现，甚至有转移瘤形成。经病理组织学检查可以确定肿瘤是否由接种的细胞产生。也可接种到腹腔或通过鼠尾静脉注射。,.,14,5、浸润性,浸润性是肿瘤细胞的扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。,.,15,6、异质性,通过肿瘤细胞培养及克隆分析发现，同一肿瘤是由具有不同生物学特征的细胞亚群构成的。这些细胞亚群的浸润性、生长率、转移能力、核型、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性均不同，这种特性被称为肿瘤细胞的异质性（heterogeneity）。,.,16,同一肿瘤内细胞的活力有差别，有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称肿瘤干细胞。只有肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分。,.,17,7、细胞遗传,大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。,.,18,体外培养肿瘤细胞的三个显著基本特征：永生性不受控增殖性致瘤性,.,19,三、肿瘤细胞系的建立,恶性肿瘤细胞培养建立细胞系，包括从人或动物恶性肿瘤取材建立癌细胞系和正常细胞在体外经理化、生物因素诱发的转化细胞系。转化细胞系可以是恶性转化细胞和一般转化细胞两种。,.,20,恶性转化细胞系和癌细胞系一样具有永生性和恶性表型，对此两种来源的细胞系鉴定也是相似的，为研究恶性肿瘤提供了有用模型。一般转化细胞系只具有无限生长能力，不具有恶性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细胞的模型而被应用。,.,21,癌细胞培养的最主要的问题是从体内到体外环境的改变。培养中发现，有些肿瘤在体内生长，但在体外却难以生长。,癌细胞系的建立,.,22,依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性。,肿瘤细胞在体外不易生长的可能原因：,癌细胞系的建立,.,23,肿瘤细胞的自分泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力。并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的生命周期，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少。离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。,癌细胞系的建立,.,24,（一）癌细胞原代培养,癌细胞建系的方法和程序相似于正常细胞，包括标本收集和处理、原代培养、传代、换液、冻存、复苏等过程。培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。,癌细胞系的建立,.,25,1、取材,人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是很好的培养材料。,癌细胞系的建立,.,26,取材后尽快将癌组织进行培养，一般4小时内细胞存活最好。标本在4存放，不宜超过24小时。,癌细胞系的建立,.,27,人癌细胞建系必须要有完整的记录，包括组织来源、病人姓名、住院号、年龄、性别、临床诊断、病理诊断（应明确分类分期）、术前放化疗情况，为细胞建系的重要材料。为了鉴定建立的细胞系来源和生物学特性，最好留有病人正常组织和血标本。,癌细胞系的建立,.,28,2、分离,单纯的机械方法分离如吹打和过滤对癌细胞损伤小。有些肿瘤如人卵巢癌、某些神经胶质瘤可采用。癌组织多为较坚实的实体，肿瘤细胞包埋在大量的纤维基质中，难以进行机械分离。因此酶消化法是分散癌细胞的好方法。,癌细胞系的建立,.,29,胰蛋白酶是分离细胞最常应用的酶，但它对结缔组织的消化能力有限，适合含结缔组织较少的肿瘤，并且对细胞膜有损害作用，影响细胞存活。胶原蛋白酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大，适于分离纤维性组织、上皮及癌组织。,癌细胞系的建立,常用酶：,.,30,胶原酶的消化方法：0.5mgml胶原酶处理，可在显微镜下观察，纤维细胞逐渐被除去为止。用Hanks液或培养基洗涤，除去附着细胞的酶，再进行接种和培养。,癌细胞系的建立,.,31,注意：当肿瘤组织标本很小，不能用酶消化获取癌细胞时，可以用组织块法进行原代培养。癌组织中不可避免有已耗竭和坏死的细胞，在酶消化前，应尽可能清除，以免接种后很快溶解破坏，释放出影响癌细胞生长的有害物。,癌细胞系的建立,.,32,3、接种细胞,消化后制备的癌细胞，培养时应有足够的细胞密度，通常接种细胞浓度为5105ml，37培养。,癌细胞系的建立,.,33,4、成纤维细胞过度生长的去除,常采用机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法和密度梯度离心法等。用选择培养基、饲养层等方法可以克服其过度生长。,癌细胞系的建立,.,34,将玻璃吸管前端在火焰上烧弯曲，用作除去成纤维细胞的工具。可在显微镜下直接刮除生长的成纤维细胞，也可事先在显微镜下对有成纤维细胞生长的单层培养瓶上做出标记，然后按标记刮除。刮除后，用培养液洗12次后，加入新培养液培养。如需要可多次刮除。,（1）机械刮除法,癌细胞系的建立,.,35,根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。,（2）反复贴壁法,癌细胞系的建立,.,36,待细胞生长达一定数量后用胰酶消化，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；取编号为A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A瓶中，置温箱中静止培养520分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B瓶中；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；培养B瓶中细胞520分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次。,癌细胞系的建立,.,37,（3）消化排除法,先是用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下观察和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。,癌细胞系的建立,.,38,（4）胶原酶消化法,本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下观察，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。,癌细胞系的建立,.,39,（5）其它方法,聚丙烯酰胺抑制成纤维细胞生长密度梯度离心等,癌细胞系的建立,.,40,5、选择性培养基,选择性培养基是针对特殊细胞生长的营养要求设计的。在癌细胞建系中，选择性培养基的应用是提高癌细胞体外存活、抑制成纤维细胞生长的关键技术改进。,癌细胞系的建立,.,41,HITES选择培养基是一种改良RPMI-1640培养基，含有氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、雌激素、硒等成分。HITES培养基适合用于人小细胞肺癌建系。,癌细胞系的建立,.,42,为了抑制成纤维细胞生长，在培养基中加入成纤维细胞的抗体或成纤维细胞代谢抑制成分，也可提高癌细胞系建系率。血清对上皮细胞有抑制作用有利于成纤维细胞生长。因此用低或无血清培养基为好。,癌细胞系的建立,.,43,6、饲养层,在培养器皿底部接种能形成接触性抑制的成纤维细胞饲养层，可以有利于癌细胞生长和抑制癌组织中正常成纤维细胞过度生长。如人胎小肠细胞（FHs74Int）、小鼠3T3细胞或STO鼠胚成纤维细胞。,癌细胞系的建立,.,44,（二）癌细胞原代培养的换液和传代,癌细胞系的建立,1、换液通常细胞产生酸性代谢产物，培养上清呈黄色时，需要及时换液，癌细胞在对数期增殖迅速，每天均需换液，倍增时间较长的细胞可以隔日换一次。,.,45,2、传代,原代培养的癌细胞应掌握合适的第二代传代时间。肿瘤细胞与正常细胞生长特点不同，表现为重叠生长。当在显微镜下观察到上皮样细胞汇合达50%左右，可见细胞层上堆积有圆形的细胞，指示细胞增殖活跃时就可以传代。,癌细胞系的建立,.,46,常规传代：原代培养物第一次传代后，需要常规传代维持细胞在体外正常生长。每种细胞系传代时间有所不同。通常在细胞接种后5天左右传代一次。一瓶癌细胞传到15瓶。如果计数细胞浓度，每瓶可接种24105细胞。为建成永久性细胞系需长期传代达50次以上。,癌细胞系的建立,.,47,3、冻存和复苏,建系过程需要不断冻存细胞以防止细胞系中断。从第一代传代后，就应尽早地冻存培养物。且冻存不同传代次数的细胞。冻存细胞和复苏方法与正常细胞相同，可参照正常细胞。,癌细胞系的建立,.,48,（三）癌细胞系建立注意事项,取材应选择活力较好的部位，尽快培养且要防止污染。及时去除生长的成纤维细胞。掌握好传代时间，细胞没有长到足够量时不要急于传代。早期应先以高浓度接种，再逐渐降低。对于增殖能力低的细胞，应放入饲养层中培养，并加入一些促生长物质。精心传代、换液、避免污染，需经半年以上的细胞培养，方能够达到建立细胞系的目的。,癌细胞系的建立,.,49,转化细胞系的建立,培养细胞的转化是指细胞发生了不可逆转的遗传改变而引起恒定的表型改变。可由细胞本身基因不稳定（啮齿类）在传代中自发发生，也可用放射、致突变剂、病毒以及外源基因等因素处理，引起细胞产生遗传改变。,.,50,转化的表型变化主要有3类：,有限分裂的细胞变为无限增殖的细胞，获得不死性，成为永久性细胞系。细胞不正常自主性生长，丧失接触抑制、过饱和密度、无停泊依赖等生长特点。致瘤性，细胞可在免疫缺陷小鼠体内浸润生长，形成肿瘤。,转化细胞系的建立,.,51,致瘤性是判断恶性转化或一般转化细胞系最主要的指标。,转化细胞系的建立,.,52,（一）诱变转化细胞的方法,1、转化细胞的选择可从原代培养的正常细胞、传代的正常细胞选择。成纤维细胞易于转化，上皮细胞较难。,转化细胞系的建立,.,53,化学致突变剂：常用的甲基硝基亚硝基胍（N-methy-N-nitro-Nnitrosoguanidine，MNNG）；物理方法：射线照射；病毒转化：用EB病毒感染淋巴细胞引起转化，SV40病毒转化正常细胞成为恶性细胞；用外源基因转染细胞，诱发细胞转化，包括癌基因如ras、mye，病毒基因如SV40LT抗原基因和端粒酶基因等。,2、转化因素,转化细胞系的建立,.,54,（二）外源基因转化细胞,程序：选择合适的外源基因，如SV40LT抗原基因转染人成纤维细胞有效。构建外源基因表达载体（质粒），含有合适的标记基因作为阳性传染细胞的选择（质粒上有新霉素耐受基因，可用G418选择）。,转化细胞系的建立,.,55,选择合适的转基因方法：化学方法最常用磷酸钙、脂质体、基因枪、电转移等。选择合适的转染细胞，易培养和传代，无自发转化能力。用转基因方法转染细胞获阳性集落。证明外源基因有无表达。证明转染细胞的表型是否改变和有无致瘤性。,转化细胞系的建立,.,56,1、SV40LT抗原基因转化人的成纤维细胞,虽然鼠来源的成纤维细胞可以经培养后成为长期培养的细胞系，但人的成纤维细胞在体外培养很难成为永久细胞系。用SV40LT抗原基因转化人的成纤维细胞是最成功的方法。,转化细胞系的建立,.,57,2、转染端粒酶基因,端粒酶在细胞内表达，抵消细胞分裂所致端粒缩短，是细胞获得不死性的重要分子机制。转染外源端粒酶基因于有限期传代的正常细胞系，包括人上皮细胞和成纤维细胞、血管内皮细胞等，均可诱导产生永久性细胞系，并证明了转染细胞中端粒酶表达和端粒缩短受到了控制。,转化细胞系的建立,.,58,SV40诱导的不死性细胞，伴有细胞不正常分化和核型不稳定，表现出对动物一定程度的致瘤性。而端粒酶转染的细胞很少有核型的改变和上皮细胞分化的特点，保持更多正常细胞的表型。说明SV40LT多引起细胞恶性转化，而端粒酶基因主要诱导细胞获得不死性。,转化细胞系的建立,.,59,3、转基因小鼠,利用转基因小鼠可以建立转化细胞系，基本方法是设计有某种基因突变、缺失、嵌入的病毒基因DNA，植入小鼠的卵母细胞。发育的转基因小鼠将携带有表达某种基因的组织，从小鼠组织取材，可以获得转化细胞系。因此，利用转基因小鼠是建立细胞系快速有效的方法。,转化细胞系的建立,.,60,（三）EB病毒感染B细胞,EB病毒感染人外周血B淋巴细胞后，B细胞便能够被转化，并在体外传代生长，建立细胞系，长期储存在液氮，解决研究中大量细胞的来源。,转化细胞系的建立,.,61,（四）转化细胞系建立注意事项,建立转化细胞系，通常用已建成的正常细胞系进行转化，所以不存在上述癌细胞建系原代培养所存在的问题。能否建成转化细胞，除要选择合适的细胞系外（遗传形状过于稳定的细胞不易转化）对转化方法的选择也很关键。从转基因小鼠组织取材建立细胞系在国外已有一些报告，该方法的应用，不仅提高了建系率，而且使那些常规细胞培养方法不能建立的细胞系，通过转基因动物可以建立携带某种靶基因的细胞系，为细胞培养和建立细胞系开拓了新的局面。,转化细胞系的建立,.,62,四、癌细胞系和转化细胞系的鉴定,癌细胞系的鉴定主要包括细胞组织来源和恶性特征。转化细胞如果是正常细胞系转化而来，不需再进行组织来源鉴定，仅明确是否已获得了不死性，经确定是恶性转化或一般转化。,.,63,1、光镜直接检查,2、细胞染色检查,3、细胞超微结构的检查,（一）细胞形态学,.,64,1、光镜直接检查,呈多边形上皮样细胞；癌细胞失去接触性抑制，呈现重叠生长。可见细胞重叠层上有折光度强的圆形细胞。这些特点可与正常上皮细胞区分，转化细胞可出现与癌细胞重叠生长相似的特点。,.,65,2、细胞染色检查,见正常细胞鉴定，除Giemsa染色外，可用瑞氏结晶紫等染色癌细胞呈多边形，排列不规则，细胞重叠。细胞核大，核浆比例增大，深染突出、不规则，可见异常分裂象。有的上皮样转化细胞有相同特点。,.,66,3、细胞超微结构的检查,细胞核大，不规则。胞浆内如观察到桥粒、张力原纤维等为上皮细胞的特点，观察到分泌颗粒是腺细胞特点，如有神经分泌颗粒是神经内分泌细胞特点。细胞超微结构检查对于鉴定细胞系的组织来源和细胞恶性特点有重要意义。,.,67,（二）染色体异常,癌细胞是异倍体，存在染色体缺失、重排和移位等异常。染色体显带技术可用于检查和鉴别正常细胞和恶性细胞染色体差异。此技术是用特殊技术将染色单体上着色出深浅带（band），显示染色体的结构。,.,68,（三）体外生长异常,癌细胞（或转化细胞）体内外无控制增殖是恶性细胞的特征。癌细胞丧失正常细胞接触性抑制、停泊依赖等生长特点，表现为增殖加速，生长呈过饱和密度，在软琼脂上形成集落等不正常生长特点。通过以下实验，对于鉴定恶性生长有重要意义。,.,69,1、生长曲线和倍增时间,培养细胞经历一代（从上一代传代到下一次传代的时间），包括潜伏期、对数期、平坦期三个阶段。通过计数7天细胞，可以记录出生长阶段，绘制出生长曲线，计算出细胞倍增时间。可鉴定癌细胞和正常细胞群体生长增殖速度的差异。,.,70,癌细胞潜伏期短，对数期生长明显，转化细胞与转化前细胞相比较，可见转化细胞对数期生长速度明显增加。依据生长曲线，可计算出细胞倍增时间。倍增时间短，反映了细胞恶性生长。,.,71,2、克隆效应（cloningefficiency）,克隆效应也可称为集落形成率（rateovcolohyformation），是检测群体细胞中增殖细胞的比率，可反应细胞系的增殖能力，因此是鉴别肿瘤细胞（或转化细胞）与正常细胞的增殖能力的指标。,.,72,肿瘤细胞和转化细胞具有较高的集落形成率，通常可达10%以上，正常细胞有较低的集落形成率