培训：食品中蛋白质的测定GB_5009.5-2010

.,食品中蛋白质的测定GB5009.5-2010第一法：凯氏定氮法,.,内容梗概,GB5009.5-2010内容简介食品中蛋白质检测方法简介第一法：凯氏定氮法（详细）第二法：分光光度法（略）第三法：燃烧值法（略）,.,GB5009.5-2010内容简介,食品安全国家标准食品中蛋白质的测定于2010年3月26日发布，2010年6月1日实施。本标准代替GB/T5009.5-2003食品中蛋白质的测定、GB/T14771-1993食品中蛋白质的测定方法和GB/T5413.1-1997婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定。统一了食品中蛋白质的测定方法，强制性,.,GB5009.5-2010内容简介,本标准与GB/T5009.5-2003相比主要修改如下：在第一法中增加了自动蛋白质测定仪的方法；增加了燃烧法，作为第三法；修改了换算系数；（复合配方食品为6.25）对计算结果的有效数字规定进行了修改；（蛋白质含量1g/100g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量1g/100g时，结果保留两位有效数字）增加pH计对滴定终点的判定。,.,蛋白质概况,蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等。在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。,.,蛋白质检测方法简介,测定蛋白质含量的常规方法有五种：1、凯氏定氮法2、乙酰丙酮比色法？3、双缩脲比色法等，（这些方法均存在着样品需要预处理、操作繁琐耗时等缺点。但凯氏定氮法和乙酰丙酮比色法作为我国食品卫生标准检测方法，分析成本低，测定结果准确，应用十分广泛。）,.,蛋白质检测方法简介,4、近红外光谱技术是20世纪80年代后期迅速发展起来的一项物理测试技术。近红外透射或反射光谱具有分析样品用量少、分析速度快和结果稳定等优点，在食品分析领域已经逐步得到了应用。5、杜马斯燃烧法比凯氏定氮法还早，近年来杜马斯燃烧法测定饲料、肥料等农产品中氮含量在我国也有了应用。,.,蛋白质检测方法简介,目前国家标准中用于检测食品中蛋白质的方法共有三种：1、凯氏定氮法（适用于各种食品中蛋白质的测定）2、乙酰丙酮分光光度法（适用于各种食品中蛋白质的测定）3、燃烧法（适用于蛋白质含量在10g/100g以上的粮食、豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定）不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。,.,凯氏定氮方法简介,凯氏定氮法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的蛋白质，后来由Gunning加入改进，在消化时加入K2SO4使沸点上升，加快分解速度，凯氏定氮法至今仍在使用。根据食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。,.,第一法：凯氏定氮法,原理：食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或者盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。其反应方程式如下：蛋白质+H2SO4（NH4）2SO4（NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4NH4OHH2O+NH3NH4OHNH3+(标准)H2SO4（NH4）2SO4(标准)H2SO4+NaOHNa2SO4+H2O,.,注：,凯氏定氮法所测得的含氮量为食品的总氮量，其中还包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、生物碱氮、无机盐氮等，由凯氏定氮法测得的蛋白质称为粗蛋白质。,.,试剂和材料,除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。4.1硫酸铜（CuSO45H2O）。4.2硫酸钾（K2SO4）。4.3硫酸（H2SO4密度为1.84Kg/L）。4.4硼酸（H3BO3）。4.5甲基红指示剂（C15H15N3O2）。4.6溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）。4.7亚甲基蓝指示剂（C16H18ClN3S3H2O）。4.8氢氧化钠（NaOH）。4.995%乙醇（C2H5OH）。,.,试剂和材料,4.10硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解后并稀释至1000mL。4.11氢氧化钠溶液（400g/L）：称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。4.12硫酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）或盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）。4.13甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。4.14亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。,.,试剂和材料,4.15溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。4.16混合指示液：2份甲基红乙醇溶液（4.13）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（4.14）临用时混合。也可用1份甲基红乙醇溶液（4.13）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（4.15）临用时混合。,.,仪器和设备,天平：感量为1mg。定氮蒸馏装置：如图自动凯氏定氮仪。,.,样品处理,称取充分混匀的固体试样0.2g-2g、半固体试样2g-5g或液体试样10g-25g（约相当于30mg-40mg氮），精确至0.001g，移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5h-1h。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。,.,蒸馏,按图装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液（1g/L）数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液(4.10)及1滴-2滴混合指示液并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0mL-10.0mL（旧10）试样处理液由小玻杯注入反应室，以10mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。,.,接收、滴定,蒸馏10min(旧5）后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH5.4；1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH5.1。同时作试剂空白。,.,分析结果的表述,X试验中蛋白质含量，g/100g（旧标准中有g/100mL）V1试样消耗硫酸或盐酸标准滴定溶液的体积，mLV2空白消耗硫酸或盐酸标准滴定溶液的体积，mLV3吸取消化液的体积，单位为毫升（mL）c硫酸或盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/Lm试样质量，g,.,分析结果的表述,0.01401.0mL硫酸c(1/2H2SO4)1.000mol/L或盐酸c(HCl)1.000mol/L标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克（g）；M试样的质量，单位为克（g）；F氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。乳制品中蛋白质的含量要结合具体的产品标准进行转换和计算。,.,结果表示,以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量1g/100g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量1g/100g时，结果保留两位有效数字。,.,精密度,在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。,.,各步骤详解,整个过程分四步：1、消化2、蒸馏3、吸收与滴定4、计算,.,第一步：样品消化,样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而蛋白质则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。下面注意几种试剂的作用：,.,硫酸钾的作用：,添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330，而添加硫酸钾后，温度可达400，加速了整个反应过程。硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。,.,浓硫酸的作用:,1、脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将H2SO4还原为SO2，本身则变为CO22、氧化3、蛋白质与浓H2SO4生成NH3，CO2，SO2，H2O4、与NH3生成硫酸铵,.,其他试剂的作用,硫酸铜，氧化汞或硒粉，催化剂，加快反应速度（但为了防止污染通常使用硫酸铜，所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，还可以作为碱性反应指示剂）。有的加少量过氧化氢、次氯酸钾作为氧化剂。50%NaOH的作用蒸馏时使溶液呈碱性,.,第二步蒸馏：,样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中。一是加入氢氧化钠溶液要过量，如果NaOH量加的不够就变成H2S，H2S是强酸，使颜色变红。二是要防止样液中氨气逸出。,.,第三步吸收与滴定：,蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。（全量）半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。（用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险起见一般用4%）。,.,滴定,.,实验注意事项,1.样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。2.样品放入K氏烧瓶时，不要粘在瓶颈上，万一粘附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。3.消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂23ml，促使氧化。4.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在K氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。5.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，样品中脂肪含量过高时或取样量较大时，要添加硫酸量，若如干试样超过5g可按每克试样5m1的比例增加硫酸用量。,.,实验注意事项,6.蒸馏装置不能漏气。氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。7.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。8.蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。,.,自动凯氏定氮仪法,称取固体试样0.2g-2g、半固体试样2g-5g或液体试样10g-25g（约相当于30mg-40mg氮），精确至0.001g。按照仪器说明书的要求进行检测。大多数实验室用FOSS的自动定氮仪，准确度、稳定性好。样品消化时可低温烘干后进行，不起大泡飞溅。,.,34,自动凯氏定氮仪法,在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。仪器：,自动蒸馏装置,消化炉,.,凯氏定氮仪设备操作sop,1、确保仪器运行正常、管道内部干净、管道及其连接口密封性好2、准备好吸收液（20ml2%硼酸+几滴混合指示剂）并做好标记3、检查碱溶液及纯化水桶是否与仪器连接好，放入盛装消化好样品的消化瓶，