凝胶渗透色谱.ppt

凝胶渗透色谱法测定分子量分布原理,实验目的1掌握GPC测定物质分子量及其分布的基本原理和仪器的使用方法。2测定样品的GPC谱图，由软件获得Mn,Mw,PDI。,色谱分类,体积排斥色谱SEC(SizeExclusionChromatography）的发展史,1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象。1959年Porath和Flodin用葡聚糖胶联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品。1962年J.C.Moore将高交联度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。,凝胶色谱的任务,分子量的分布与高分子材料的所有关键加工特性以及材料性能紧密相关,PlasticsTechnology,May1986,聚合物的各种平均分子量,用SEC测得的不同种平均分子量可对应于其他仪器所测的值：Mn：用渗析计测出(Osmometry)Mw：用光散射计测出(LightScattering)Mv：用粘度计测出(Viscometry)Mz及Mz+1：用超速离心法测出(Ultracentrifuge)Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity)MnMvMwMzMz+1,分子量分布,增加分子量,PD=Mw/Mn,增加浓度,聚合物的分子结构,单分散性聚合物,窄分布聚合物,中等分布聚合物,宽分布聚合物,Mw/Mn=1.00,Mw/Mn1.20,Mw/Mn2.00,分子量分布,体积排斥色谱（SEC)工作原理,以多孔树脂为固定相，用溶剂推动分子量大小不同的样品流过固定相产生大小分子顺序流出的分离流出级份的保留时间（洗脱体积）提供其分子量（尺寸）的信息用检测器得到各流出组分的强度和流出时间用已知分子量的标样标定出流出时间和分子量的关系用标定好的时间和分子量的关系对未知样各流出级份的时间（分子量）和强度进行统计计算得到分子量分布,色谱仪组成示意图,In,Out,S,R,缓冲柱,色谱柱,溶剂输送系统,在线脱气,放空阀,废液管,示差折光检测器恒温区,废液,溶剂,进样阀,柱温箱,预热板,自动进样器,凝胶渗透色谱HLC-8320GPC生产厂商：日本东曹株式会社,HLC-8320GPC操作规程1打开电脑，点击EcoSEC-WS工作站，输入密码，进入采集控制应用程序。2开启仪器电源，点击工作站控制系统Power按钮，待联机显示成功后，设定流速、温箱温度和检测条件。3设定WarmUp时的流速和待机时间，并执行该程序。4将待测样品放入样品托盘，设定运行时间、数据采集时间、样品测定序列，执行Analysis程序，进行标准物质和样品的测定及数据处理。5测试完毕后，执行ShutDown程序，待控制面板显示PowerOff后关闭仪器电源和电脑。,凝胶渗透色谱(GPC:Gelpermeationchromatography)主要用于聚合物领域以有机溶剂为流动相(氯仿，THF，DMF)常用固定相填料：苯乙烯二乙烯基苯共聚物凝胶过滤色谱(GFC:Gelfiltrationchromatography)主要用于生命科学领域以水溶液为流动相常用固定相填料：亲水性有机凝胶(葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺等),SEC分类,GPC载体的种类：1.交联聚苯乙烯凝胶2.多孔性玻璃3.半硬质及软质填料包括聚乙酸乙烯酯凝胶及聚丙烯酰胺凝胶4.木质素凝胶等,DVB/PSPackingParticle20,000 x,有机GPC介质,悬浮聚合产生苯乙烯基二乙基苯聚合物的单体颗粒开始的小颗粒融合集合成最终的颗粒仔细控制反应环境产生出合适的单体孔和颗粒的尺寸,PoreStructureDefinesResolvingRange,体积排除分离机理,GPC是如何工作的,SEC体积排除色谱（GPC）不同于HPLC,没有化学作用。SEC体积排除色谱（GPC）依靠单纯的物理分离原理。,凝胶色谱柱的分离,参数,色谱柱体积,+,+,+,填料颗粒尺寸,0,+,+,填料颗粒的孔隙率,+,0,+,填料颗粒的形状,0,0,0,孔的尺寸分布,+,0,+,孔的形状,0,0,0,0=可以忽略的因素+=影响适中的因素+=影响很大的因素,凝胶柱的分离按照尺寸进行,峰的分离,峰加宽,分辨率和准确率,色谱柱填料:,色谱柱对GPC/SEC色谱分离的影响,分子量MWvs.淋洗体积,淋洗体积(mL),Log(分子量MW),GPC/SEC体积排斥色谱,排阻极限-不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。随固定相不同，排阻极限范围约在400至60106之间。渗透极限-能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量。在选择固定相时，应使欲分离样品粒子的相对分子质量落在固定相的渗透极限和排阻极限之间。,为GPC加热的理由,使GPC检测处在一个温度稳定的环境降低流动相黏度，使得谱柱内部溶剂处于接近理想的GPC状态（如PolyethyleneTerphthalatem-Cresol+0.05mLiBr/100C）尽量减轻分子间的弱相互作用（样品分子间、样品和溶剂分子间、填料和样品分子间等）使难于溶解的样品得以溶解（如聚烯烃PEPP、工程塑料PPS等）,溶剂特性,PolyisobutylenePolybutyleneChlorinatedRubberPolybutadienePolyisoprenePolydimethylsiloxaneChlorinatedPolyethylenePolyethyleneEthylacrylatePolyethyleneVinylacetonePolyethyleneMethacrylicacidPolyphenyleneoxidePoly-4-methylpentene(1)PolyethyleneUltra-highMolecularWeightPolyethylenePolypropylenePolyetheretherketonePolyetherketone,TolueneToluene/75%TCB/135-160CTCB/135-160CPhenol/TCB1:1/145C,各种样品所对应的溶剂条件,各种样品所对应的溶剂条件,MelamineFormaldehydeNylon(Alltypes)PolybutyleneTerphthalate(PBT)PolyethyleneTerphthalate(PET)PolyAcrylonitrile(聚丙烯睛)ABS(AcrylonitrileButadieneStyrene)ASA(AcrylicStyreneAcrylonitrileABA(AcrylonitrileButdieneAcrylate)CarboxymethylCelluloseABS/PolycarbonatePolybutadieneAcrylonitrilePolyurethanePolyacetalPolyoxymethylenePolyimidePolyamideimidePolyetherimidePolyethersulfonePolyvinyldienefluoridePolyfuranFormaldehyde,Hexafluoroisopropanol+0.075MSodiumTrifluoroacetate/55Corm-Cresol+0.05mLiBr/100CDMF+0.05mLiBr/85CDMF+0.05mLiBr/145CN-MethylPyrrolidone+0.05mLiBr/100CDimethylacetamide/60C,PolycarbonatePolyglycolicacidAcrylonitrileMethylmethacrylateCelluloseAcetateCelluloseAcetateButyrateCelluloseAcetateProprionateCelluloseNitrateCelluloseProprionateCelluloseTriacetateDiallylPhthalateEthylCelluloseEpoxyPolyesterAlkydPolybutene(1)PolybutadieneStyrenePhenolFormaldehydePhenolFurfuralPolymethylmethacrylatePolypropyleneglycolPolystyrenePolysulfonePolyvinylacetatePolyvinylbutyralPolyvinylchloridePolyvinylchlorideAcetatePolyvinyldienechloridePolyvinylformalPolystyreneAcrylonitrilePolystyreneAlphamethylstyrenePolyesterThermosetPhenolicsRosinAcidsPolyglycolicAcid,MethylChloridegamma-ButylLactoneTHF/40C,参数,溶质构造,+,+,+,溶剂流速,0,+,+,溶剂粘度,0,+,+,温度,0,+,+,0=可以忽略的因素+=影响适中的因素+=影响很大的因素,峰的分离,峰加宽,分辨率和准确率,影响GPC/SEC色谱分离操作参数的因素摘要,4凝胶渗透色谱的特点,实验所需时间可以预知整个洗脱过程用恒定比例的淋洗液，不能用梯度洗脱一般情况下试样能溶解就能测定，减少了用于摸索实验条件所需的时间组分的保留时间提供其分子尺寸的信息以时间顺序流出的级份进行分级收集就得到了目标分子量的样品可以进一步分析（GPCcleanup）,Temp.(DegC),18.5,19.0,19.5,20.0,MV,-1.00,0.00,1.00,2.00,Minutes,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,实验室温度波动对RI检测器基线的影响,MobilPhaseMethanol0.25/mLminuteDetectorTemp35CNoColumnHeaterUsed,RoomTemperature,RIBaseline,分离式系统温度稳定性的解决方案与色谱追求的分离度相矛盾（柱外扩散）,多检测器集成的GPC系统,紫外检测器（浓度型）粘度检测器（分子量型）多角激光光散射检测器（分子量型）红外接口（特征基团型为测量短链支化）,影响凝胶渗透色谱数据的因素,输液系统样品制备进样系统柱温变化色谱柱性能检测器流动相标样类型的选择和分子量范围的选定,溶剂输送系统,高流速精度是获得重现性GPC结果的基础微小的流速误差会导致分子量计算的很大误差使用参考峰(FlowMarkers)的技术可校正流速误差,固态(半结晶),液态(稀溶液),样品制备的影响,溶剂必须聚合物链打开成最放松的状态允许充分的时间让链展开有些聚合物需要大于3小时分子量及结晶度愈大，所需真正溶解的时间就越多某些结晶的聚合物需要加热,除非该样品可能会有剪切效应发生，聚合物溶液必须过滤为了增加样品的溶解，可轻微扰动（不要剧烈摇动或用超声）窄分布标样不必过滤，高分子量标样也不要剧烈摇动可使用在线过滤器，但是不推荐使用保护柱,由于凝胶色谱中浓度检测通常使用示差折光检测器，其灵敏度不太高，所以试样的浓度不能配置得太稀。但另一方面色谱柱的负荷量是有限的，浓度太大易发生“超载”现象。一般情况下，进样浓度按分子质量大小的不同在0.050.5%（质量分数）范围内配置。分子质量越大，溶液浓度越低。标样配制应该严格按照标样说明书进行。通常室温静置12小时以上，然后轻轻混匀。绝对不能超声或者剧烈振荡来加速溶解。溶液进样前应先经过过滤，以防止固体颗粒进入色谱柱内，引起柱内堵塞，损坏色谱柱。,40瓶位样品盘2ml玻璃瓶卷边压紧铝瓶盖优先进样的样品缓慢搅拌双温区设计是降解风险降至最低,进样点,50,100,200,温度(C),-20,-10,0,10,20,瓶位,CarouselMotion,进样点,Agitated,自动进样器,在柱温箱中平衡的进样瓶可编程ExcesssolutionreturnedtovialInjectionprecisionRSD1%withnocrosscontaminationNewMultipleInjectioncapabilityupto3injectionspervial.,柱温箱,进样阀,MIXEDbedcolumnsgiveextendedrangeoverindividualporesizeManufacturedtogivenodiscontinuities,CombineindividualporesizecolumnstoextendrangeCancausepeakshapevariationduetomismatchinporevolume,色谱柱对数据的影响,GPC色谱柱选择,按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系列-溶剂一般为THF、氯仿、DMF等，必须选择合适的溶剂来溶解聚合物。按照样品分子量范围来选择柱子型号-样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围内，并且最好是处在校正曲线线性范围内柱效率N和分离度R-色谱柱的效率可借用“理论塔板数”N进行描述。两个样品达到完全分离，R应等于或大于1，如果R小于1，则分离是不完全的。,聚苯乙烯(PS，溶于各种有机溶剂)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚环氧乙烷(PEO，也叫聚氧化乙烯，溶于水)聚乙二醇(PEG，溶于水)(PEO与PEG的碳链骨架相同，但是其合成原料和封端不同，由于原料的性质，使其产物的分子量和结构都有一定的区别。PEO常是指一端为甲基封端，一端为羟基封端的聚环氧乙烷，而PEG一般是两端都是羟基封端的聚乙二醇。),标样,样品分子量应该处在标样分子量范围以内。,分子量校准曲线,凝胶渗透色谱的发展,多检测器的应用快速GPC技术微流量GPC技术新型色谱柱技术,多检测器的比较,用多检测器GPC技术探究poly(n-butylmethacrylate)的支化结构,TheMWDsindicatethesamplestobeextremelyheterogeneousandgavemulti-modaldistributions.,TheMark-Houwinkplotsshowthatalthoughtwoofthesamples(greytraces)weresimilarinstructure,thethird(blacktrace)gavelowervaluesofintrinsicviscosityatanygivenmolecularweight,indicativeofthemoredensepolymerstructurewhichaccompaniesanincreaseinthelevelofpolymerbranching.,聚合物色谱中的检测器,浓度响应值正比于浓度C实例：示差(refractometer)检测器N=(dn/dc)C紫外检测器蒸发光散射检测器使用单一浓度型检测器的体积排除分离模式色谱被称作传统GPC,浓度示差，紫外，蒸发光散射(ELSD)，分子量敏感粘度，光散射组成多波长紫外，示差+紫外，质谱(MS)，付里叶变换红外(FTIR)，,“绝对”分子量分布的测定,RI/V检测器结合使用VI的响应值正比于CH/M=CH，大分子的尺寸；流体力学体积=VI/RI，特征粘度(intrinsicviscosity)普适校正的假设：具有同样大小(H)的大分子应有同样的洗脱体积，即依赖性在给定的流动相、色谱柱组及温度下，H=H(V)是通用的,LogH,2,4,6,8,10,ElutionvolumeV,mL,16,18,20,22,24,26,28,RI/V检测器结合使用，第一步：用任何窄分布标样(化学结构不重要)建立普适校正曲线,ST=VI/RIforeachstandardH=MSTSTforeachstandardPolynomialfittoLogHuniversalcalibrationcurve,“绝对”分子量分布的测定,RI/V检测器结合使用第二步：用聚合物分布每一切片“i”计算“绝对”分子量i=VIi/RiiMi=Hi/i,1683Run1,1683Run2,1683Run3,1683Run4,1683Run5,3.00,4.00,5.00,6.00,7.00,