遗传实验05：人外周血培养与染色体制备fh

遗传学实验,人类外周血培养及染色体核型分析,一、实验目的：,1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。,二、实验原理：,1、植物血凝素的作用外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。,2、秋水仙素的作用：秋水仙素(colchicine)可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。,3、低渗的原理：徐道觉(T.C.Hsu)等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。,4、核型和带型：,核型(karyotype)：是指染色体组在有丝分裂中期的表型,是染色体数目、大小、形态特征的总和。在对染色体进行测量计算的基础上,进行分组、排队、配对,并进行形态分析的过程叫核型分析。将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。,带型（bandingpattern）即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。,三、实验用具及试剂：,实验仪器及用具：恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪；培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。,.,2.实验试剂：,外周血淋巴细胞培养基2%碘酒75%酒精20g/ml秋水仙素0.075mol/LKCl溶液甲醇冰醋酸Giemsa原液1/15mol/L磷酸缓冲液,四、实验步骤：,1、采血：将皮肤常规消毒后静脉采血约0.5ml。2、种血及培养：将采到的血样立即接种到培养瓶内，每个培养瓶接28或30滴（约0.5ml），轻轻摇匀后将培养瓶放在37温箱中培养72小时。培养过程中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。3、秋水仙素处理：在终止培养前2-3小时，向培养瓶中加20g/ml的秋水仙素3滴，轻轻摇匀后继续培养到72小时。,4、制片：（1）离心：从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转入10ml的刻度离心管内。2000转/分，离心10分钟。（2）低渗：弃去上清液。加入37预热的0.075mol/LKCl低渗液8ml，用吸管轻轻吹打匀，放在37恒温水浴中40分钟。(此时配固定液：甲醇225ml+冰醋酸75ml)2000转/分，离心10分钟。（3）预固定：弃去上清液，在离心管中加入现配的预温的甲醇-冰醋酸(3:1)固定液约1ml，轻轻混匀,室温固定5分钟。,（4）再次离心：2000转/分离心10分钟。（5）第一次固定：弃上清液，加入固定液约8ml，立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温固定20分钟。2000转/分离心10分钟。（6）第二次固定：同第一次固定。（7）弃上清液，加入固定液0.5ml，用吸管吹打使均匀后制成细胞悬液。用封口膜封口，4保存备用。,（8）滴片：在30-40cm高处将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。（9）染色：用10%吉姆萨染液扣染30分钟，染色结束后用清水将浮色冲去，干燥后即可进行镜检。（10）照相：在显微镜下寻找分散较好的分裂相(核型)，再置于显微照相仪下拍摄照片，并保存。（11）核型分析：应用核型分析软件，进行染色体核型分析。,核型分析仪及核型分析,五、注意事项:,1、秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。2、低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。3、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。4、固定液应在使用前临时配制。5、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。,六、实验结果与分析：,染色体核型分析：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男性为46，XY；女性为46，XX。,A组（No.13）：是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部，为中部着丝粒染色体；B组（N0.45）：为两对大的亚中部着丝粒染色体，它们有明显的长臂和短臂；C组（N0.612+X）：为中等大小的亚中部着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于期间，一般难以区分；D组（N0.1315）：为中等大小的近端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；,人类染色体分组,E组（N0.1618）：包括一对中着丝粒染色体（16）和两对亚中着丝粒染色体（17、18）；F组（N0.1920）：为两对小的中部着丝粒染色体；G组（N0.2122+Y）：为最小的一组近端着丝粒染色体，在N0.2122的短臂上可见随体。Y染色体常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。人类染色体核型分析结果,重要参数：,（1）染色体的相对长度（2）臂比率（3）着丝点指数,七、作业及思考题：,1、将分散良好的标本进行显微照相；2、观察人类染色体的形态、结构特点；3、对比男性和女性的染色体标本，比较异同；4、总结做好本实验的关键因素。,八、参考文献：,医学遗传学基础与临床.程在玉，伦玉兰.山东：青