色谱法薄层色谱和柱色谱

有机化学实验,色谱法（薄层色谱、柱色谱）,一.实验目的,学习薄层色谱和柱色谱技术的原理和应用；掌握用薄层色谱和柱色谱分离和鉴定化合物的操作技术。,二.实验原理和实验技术,色谱法：分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。,色谱法基本原理：利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。,流动的体系称为流动相（气体或液体）；固定不动的物质称为固定相（可以是固体或液体）。,根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等；,根据操作条件不同，可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。,二.实验原理和实验技术,薄层色谱（TLC，薄层层析）,薄层吸附色谱的工作原理：,特点：所需样品少，分离时间短，效率高。,应用：精制样品，鉴定化合物，跟踪反应进程和柱色谱的摸索最佳条件等。,组分,固定相,流动相,吸附剂（固定相）,展开剂（流动相）,样品点（多组分）,吸附竞争,斑点的最高浓度中心至原点中心的距离,展开剂前沿至原点中心的距离,比移值Rf：,比移值Rf在一定条件下和溶质（组分）的分子结构、性能有关，不同的溶质在色谱分离过程的比移值是不同的。但对同一溶质在相同条件下进行色谱分离时，比移值是一个特定的常数（定性分析的依据）。,由于吸附剂（硅胶、氧化铝等，强极性）对样品中各组分吸附能力不同（极性强的组分被吸附能力越强），当展开剂（常常是具有一定极性的有机溶剂）流经吸附有样品的吸附剂时，展开剂与样品中的各组分对吸附剂产生竞争吸附，极性小的组分从吸附剂上解吸较易，随展开剂较快地移动；极性大的组分从吸附剂上解吸较难，随展开剂移动较慢。,二.实验原理和实验技术,薄层色谱（TLC，薄层层析）,固定相的选择：,硅胶和氧化铝是薄层色谱常用的固定相，两者都属于极性吸附剂。,硅胶的型号：60G、600GF254、60H、60HF254和60HF254+366等,薄层吸附色谱（固定相为极性吸附剂）中，化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较强极性的化合物吸附较强，即Rf值较小。,无机盐、离子型有机物,磺酸、羧酸,醇、酚、胺,醛、酮、酯,卤代烃、醚,芳香烃,烯,环烷烃,烷烃,常见有机化合物的极性大小：,硅胶：（吸附性）表面的Si-OH基（应用）分离酸性、中性有机物,氧化铝：（吸附性）铝原子上未成键的电子对（应用）分离碱性、中性有机物,二.实验原理和实验技术,薄层色谱（TLC，薄层层析）,展开剂的选择：,选择展开剂时，要考虑样品各组分的极性、溶解度和吸附活性等因素。,常用展开剂的极性大小顺序（仅对硅胶和氧化铝适用）：,一般情况下，溶剂的展开能力与溶剂的极性成正比。,溶剂的极性大,溶剂对化合物的解吸能力强,Rf值大,己烷、石油醚环己烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯苯二氯甲烷氯仿乙醚四氢呋喃乙酸乙酯丙酮正丁醇丙醇乙醇甲醇水冰乙酸吡啶乙酸,如果单一展开剂分离效果不显著，可选用混合溶剂。,环己烷乙酸乙酯混合溶剂（）,二.实验原理和实验技术,柱色谱,吸附柱色谱的工作原理：,在色谱柱中填入表面积很大、经过活化的多孔性粉状固体吸附剂（硅胶、氧化铝）。分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带。再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集。,二.实验原理和实验技术,柱色谱,吸附剂的选择：,常用的吸附剂：氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。,吸附剂要求：不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用；吸附剂的粒度大小要均匀。,粒度小，表面积大，吸附能力强，分离效果好，但流速慢；粒度大，表面积小，吸附能力弱，分离效果差，但流速快。,氧化铝：酸性（分离酸性物质，如有机酸类化合物）中性（分离中性物质，如醛、酮、醌和酯类化合物）碱性（分离碱性物质，如碳氢化合物、生物碱、胺等）,本实验吸附剂：中性氧化铝（150目）,二.实验原理和实验技术,柱色谱,溶剂、洗脱剂的选择：,选择原则：取决于样品各组分的极性；极性小的组分用极性小的洗脱剂进行洗脱；极性大的组分用极性大的洗脱剂进行洗脱。,极性大的洗脱剂对极性大和小的组分洗脱能力都很强。,除单一溶剂外，也可采用混合溶剂，或采用梯度（开始是低极性溶剂，后面是高极性溶剂）,最终选择：根据各组分的极性，采用TLC技术确定。（在TLC中能使各组分分开的展开剂即可做为柱色谱的洗脱剂。）,二.实验原理和实验技术,薄层色谱和柱色谱,相同点：薄层色谱和柱色谱都属于液固吸附色谱，都是经过在吸附剂和展开剂（洗脱剂）之间的多次吸附溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，实现混合物的分离。,不同点：,薄层色谱：是将吸附剂涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动。,柱色谱：是将吸附剂装于柱中，当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，从而达到分离的目的。,三.实验装置,薄层色谱,柱色谱,层析缸,薄层板,层析柱,四.实验步骤,薄层色谱,（1）薄层板的制备：（略）,（2）点样：,取出制好的薄层板，分别在距一端lcm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。取管口平整的毛细管插入样品溶液中，在一块板的起点线上点5%间硝基苯胺的苯溶液、1%的偶氮苯的苯溶液和1%苏丹的苯溶液三个样点。在第二块板的起点线上点混合液及未知物A/B两个样点，样点间相距约1.5cm左右。如果样点的颜色较浅，可重复点样，重复点样前必须待前次样点干燥后进行。样点直径不应超过2mm。,间硝基苯胺,偶氮苯,苏丹,点样用的毛细管必须专用，不得弄混。,使毛细管液面刚好接触到薄层板即可，切勿点样过重而使薄层破坏。,用无水环已烷乙酸乙酯混合溶剂为展开剂。在层析缸中放约15mL的展开剂，盖上盖子使容器被展开剂蒸汽饱和分钟左右，然后把薄层板小心放入层析缸内。点样一端应浸入展开剂约0.5cm。盖好盖子，观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm处取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，晾干后观察分离的情况，比较三者Rf值的大小，并根据Rf判断出未知物中所含的组分。,（3）展开：,原点（点样线）勿浸入展开剂中！,动作要快！否则溶剂前沿很快消失。,当溶剂液面下降至与滤纸面相近时(勿使滤纸变干)，关闭活塞，用长的滴管将上述混合液小心加入柱顶，打开活塞，当液面下降与滤纸相近时，关闭活塞，再小心加入2mL95%乙醇，重复上述操作两次，然后小心加入足量95%乙醇，打开活塞，使滴下速度为12滴/秒。蓝色的亚甲基蓝首先向柱子下端移动，甲基橙则留在柱子上端。当蓝色的亚甲基蓝快从柱子里流出时，更换一个接受器立即计量收集(用量筒)。继续洗脱，至滴出液体近无色为止（即蓝色液全部流出后），再换一接受器，改用水洗脱至橙色的液体开始滴出，用另一接受器计量收集被洗脱甲基橙水溶液，直至无色为止。这样两种组分就被分开了。实验结束后，将氧化铝从柱顶倒置倒出，把柱子洗净归还。,四.实验步骤,（1）装柱（湿法）,安装好色谱柱（垂直），以50mL锥形瓶作洗脱液的接受器。向柱内倒入95%乙醇至柱高3/4处，打开活塞，控制滴出速度为l滴/秒，收集滴下的溶剂，通过干燥的长颈玻璃漏斗慢慢加入15g中性氧化铝。用橡皮塞或手指轻轻敲打柱身，使填装紧密均匀，不断补充乙醇（收集的），勿使氧化铝柱层变干，让溶剂保持流动一段时间，至氧化铝顶部不再下降，将一张内径略小滤纸盖在氧化铝层顶部，以保护氧