何首乌、虎杖中大黄素-8-O-β-D- 葡萄糖苷的分离纯化

本科毕业设计（论文）题 目：何首乌、虎杖中大黄素-8-O-D- 葡萄糖苷的分离纯化专业： 学号： 姓名： 指导教师： 20 年5月目 录摘 要1ABSTACT2第一部分 文献综述31 化学成分研究31.1何首乌31.2虎杖42 药理作用52.1 何首乌的药理作用52.1.1 抗衰老作用52.1.2 对心脑血管的作用62.2虎杖的药理作用82.2.1对心血管系统的影响8.4对基因表达的影响102.3大黄素-8-O-D-葡萄糖苷的研究进展113 展望11第二部分 何首乌、虎杖中大黄素-8-O-D-葡萄糖苷的分离纯化研究11第一章 前言12第二章 正文121 实验材料131.1 药品131.2试剂131.3实验仪器131.4 HPLC流动相配制142 实验方法及步骤142.1 何首乌和虎杖的提取方法142.2何首乌和虎杖中EG的分离纯化方法142.2.6 EG纯度检测173 分离纯化流程图173.1 何首乌的分离纯化流程183.2虎杖的分离纯化流程184 实验结果194.1.1何首乌EG分离纯化204.1.2虎杖EG分离纯化234.2.1何首乌EG纯度检测244.2.2虎杖EG纯度检测255 结论256讨论25致 谢33摘 要何首乌是蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，虎杖是蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc的干燥根茎及根。二者在已有报导其二者中含有的大黄素蒽醌类化合物具有抗肿瘤、消炎和抑菌等活性，而这两种传统中药中含有的大黄素-8-O-D-葡萄糖苷相对于临床常用的抗肿瘤药环磷酰胺（CTX）及顺铂（DDP）等更具有更小的肝毒性和肾毒性，具有很好的临床应用前景。本文通过大孔树脂柱、聚酰胺、硅胶等柱分离方法，从何首乌及虎杖中分离纯化大黄素-8-O-D-葡萄糖苷，并通过HPLC对其进行含量测定，从而探索大黄素-8-O-D-葡萄糖苷的制备工艺。结果：1.何首乌依次经过大孔树脂、聚酰胺、两次的硅胶柱层析可以分离纯化出纯度较高的EG，成本低，易推广。2.虎杖依次经过乙酸乙酯萃取、聚酰胺柱层析可以分离出含EG含量较高的粗组分，且在HPLC检测中与杂质峰分离较好，后续可用硅胶柱层析继续分离，其分离纯化是可行的。关键词：何首乌、虎杖、大黄素-8-O-D-葡萄糖苷、分离纯化ABSTACTKey words: Polygonum multiflorum ；Polygonum cuspidatum；emodin-8-O-D-glucoside；separation and purification第一部分 文献综述1 化学成分研究1.1 何首乌中药何首乌为蓼科植物 Polygonum muhiflorum Thunb的干燥块根，我国大部分地区有出产。何首乌味苦、甘、涩，性微温，归肝、肾经，制用可补精益血，生用则有解毒、截疟、润肠通便之功。1何首乌的化学成分研究最早见于1975 年 ，Hata 等报道2从中国首乌中分离得到了新的二苯乙烯类化合物 2，3，4，5-四羟基二苯乙烯-2-O-D-吡喃葡萄糖苷。之后，Nonaka 等3 1982 年报道从中国首乌中分离得到了原花青素类和蒽醌类成分。随着化学成分研究的深入，何首乌所含化学成分被相继发现。目前，已发现的何首乌中主要活性成为蒽醌类、二苯乙烯苷类、黄酮类、磷脂类等，具体如下：（1） 蒽醌类何首乌中含蒽醌衍生物约 1.1%。大黄素、大黄素甲醚、大黄素-1，6-二甲醚、大黄素-8-甲醚、-羟基大黄素、-羟基大黄素-8-甲醚、2-乙酰基大黄素、大黄素-8-O-D-吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-D-吡喃葡萄糖苷4、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素5、大黄酚-8-O-D-吡喃葡萄糖苷 6、大黄素乙醚 7、洋地黄蒽醌8。（2） 二苯乙烯苷类何首乌中含有大量的 2，3，5，4-四羟基反式二苯乙烯-2-O-D-吡喃葡萄糖苷。2，3，5，4-四羟基反式二苯乙烯-2，3-二-O-D-吡喃葡萄糖苷（何首乌丙素）9、2，4，6，4-四羟基反式二苯乙烯-2-O-D-吡喃葡萄糖苷10、2，3，5，4-四羟基反式二苯乙烯-2-O-（2-O-没食子酰）-D-吡喃葡萄糖苷、 2，3，5，4-四羟基反式二苯乙烯-2-O（3-O-没食子酰）-D-吡喃葡萄糖苷、 11、2，3，5，4-四羟基顺式二苯乙烯-2-O-D-吡喃葡萄糖基-（16）-D-吡喃葡萄糖苷 12、2，3，5，4-四羟基反式二苯乙烯-2-O-（2-O-阿魏酰）-D-吡喃葡萄糖苷、2，3，5，4-四羟基反式二苯乙烯-2-O-（2-O-对香豆酰）-D-吡喃葡萄糖苷、 2，3，5，4-四羟基反式二苯乙烯-2-O-（6-O-D-吡喃葡萄糖）-D-吡喃葡萄糖苷13 14、土大黄苷15。（3） 黄酮类（+）-儿茶素、（+）-表儿茶素、3-O-没食子酰-（-）-儿茶素、3-O-没食子酰-（-）-表儿茶素、3-O-没食子酰原矢车菊素、 3，3-二-O-没食子酰原矢车菊素11、槲皮素-3-O-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-D-阿拉伯糖苷16、苜蓿素4、1，3-二羟基-6，7-二甲基山酮-1-O-D-吡喃葡萄糖苷（何首乌乙素）。9（4） 磷脂类对何首乌、制何首乌的总磷脂及组成成分的含量进行研究发现，野生品中含总磷脂 0.15%-0.30%；而制何首乌由于炮制品经高温蒸制后磷脂成分氧化分解。导致磷脂含量大大降低，仅为 0.041%。磷脂组份中以 PC 含量较高，占总磷脂 40%-55%。另外，随着贮藏时间的延长，磷脂含量相应降低17。（5） 其他成分决明酮-8-O-D-吡喃葡萄糖苷、没食子酸甲基酯、吲哚-3-（L-氨基-羟基丙酸）甲酯6、没食子酸、2，6-二羟基-苯甲酸、1，2-二羟基丙烷-1-（4-羟基-苯基）、（+）-lyoniresinol-3- O-D-吡喃葡萄糖苷12、2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃醌、穆坪马兜铃酰胺、N-反式阿魏酰基-3-甲基多巴胺、胡萝卜苷4、顺式和反式-E-3-丁烯基太内酯-4,5,6,7-四氢-6，7-二羟基-1（3H）-异苯并呋喃酮10、2，3，4，6-四羟基苯乙酮-3-O-D-吡喃葡萄糖苷16、torachrysone-8-O-D-吡喃葡萄糖苷18、大黄酚蒽酮19。1.2 虎杖中药虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc的干燥根茎及根。我国大部分地区均产，主产于江苏、江西、山东、四川等地。虎杖味苦，微寒，归肝、胆、肺经，有利湿退黄、清热解毒、散淤止痛、化痰止咳的功效。1 文献报道虎杖中化学成分有：芪类(二苯乙烯类)、蒽醌类20、萘醌类、黄酮类及其它一些酚类成分21其中芪类和蒽醌类成分含量较高。具体如下：(1)芪类白黎芦醇、白黎芦醇苷。(2)蒽醌类大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、大黄素甲醚-L-O-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-D-葡萄糖苷、大黄素-8-单甲醚、6-羟基芦荟大黄素、6-羟基芦荟大黄素-8-单甲醚。22(3)黄酮类槲皮素、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、木犀草素-7-葡萄糖苷、芹菜黄素的3个衍生物。23(4)酚类迷人醇、儿茶素、原儿茶酸、2，5-二甲基-7-羟基色原酮、7-羟基-4-甲氧基-5-甲基香豆素、3-甲基-5-羟基-7-甲氧色酮、决明松-8-O-葡萄糖萘苷、7-乙酰基-2-甲氧基-6-甲基-8-羟基-1，4-萘醌、塑体醌C、2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基-胡桃醌、没食子酸、色氨酸、2，6-二羟基苯甲酸、(+)-儿茶素-(+)-5-O-D-吡喃葡萄糖苷。20(5)其它成分虎杖中含有一种分子量约6000的多糖，其中含38个单糖，由D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖构成，其组成比为28：4：4：1：1；还含有游离氨基酸，Cu、Fe、Mn、Zn和K等微量元素、鞣质。24，252 药理作用2.1 何首乌的药理作用（摘自69）2.1.1 抗衰老作用研究表明何首乌中的二苯乙烯苷类成分(ST1)具有较强的体外抗氧化能力和清除活性氧作用，且具有良好的量效关系，是一种较强的抗氧化剂26。宋士军等报道，何首乌70%乙醇提取物可通过降低小鼠脑组织和肾组织的脂褐素含量，升高心肌Na+/K+-ATP酶活性和肝脏SOD活性来有效对抗D-半乳糖所致的小鼠亚急性衰老27。另外制首乌多糖可明显升高D-半乳糖所致衰老小鼠血中SOD、CAT、GSH1Px的活力，降低血浆、脑匀浆中LPO的水平28。对于用兴奋性神经毒素海人藻酸(KA)损伤基底前脑Meynert核团、内侧隔核及斜角带核所建立的老年痴呆大鼠模型，何首乌喂饲组与对照组相比，其投射到海马及大脑皮质的AChE纤维数目增多，且纤维形态无破坏，证明何首乌对大鼠脑胆碱能神经投射纤维有保护作用29。另有研究表明，何首乌粉拌食组大鼠与同月龄大鼠相比，下丘脑视周核内生长抑素能神经元细胞数的减少程度、灰度值的减少程度和细胞面积的缩小程度均显著减轻30。姚谦明等通过脑组织切片免疫组化法测定Blc-2基因表达并作比较分析，发现何首乌制剂能增加大鼠和急性脑缺血长爪沙鼠脑内Blc-2基因的表达，从而提高脑细胞抗衰老能力31。何首乌提取物可改善酪氨酸高饮食小鼠大脑海马的海绵状改变，降低脑内脂褐素、丙二醛浓度，增强学习记忆能力。何首乌制剂还可使老年大鼠脑内D2受体显著增加，改善老年大鼠中枢多巴胺能神经的功能，也可显著改善SAMP8小鼠的相似衰老病理改变32-34。何首乌醇提物能促进细胞分裂、增殖，延长大鼠皮肤二倍体成纤维细胞的传代数，使细胞进入衰老期的时间明显延迟35；可明显提高经紫外线照射损伤后大鼠外周淋巴细胞DNA复制后合成指数水平，提高大鼠淋巴细胞DNA修复能力36；可提高小鼠抗疲劳及耐缺氧能力，显著延长小鼠游泳时间和缺氧生存时间，显著降低小鼠在高温环境下的死亡率，延长生存时间37。以上提示，何首乌的抗衰老作用是一种综合作用。2.1.2 对心脑血管的作用实验表明，何首乌的50%乙醇提取物可对抗结扎抗沙土鼠大脑中动脉造成的局部脑缺血，减少大脑梗死灶近50%38。其活性成分二苯乙烯苷能抑制啮齿动物脑缺血再灌注所导致的脑组织NMDA受体结合力升高，降低神经细胞内钙离子浓度，减轻钙超载所致的脑组织损伤39。陈万生等报道，制首乌中的新化合物2，3，5，4c-四羟基二苯乙烯-2 -O-(6d-O-A-D-吡喃葡糖)-B-D-吡喃葡糖苷是制首乌水溶性部位的心血管活性成分之一，可浓度依赖性地抑制PDGF诱导的血管平滑肌细胞增殖40。另外，何首乌还有血管舒张作用，其活性提取物大黄素和蒿属香豆素可剂量依赖性地缓解苯肾上腺素导致的胸动脉环前收缩41。何首乌乙酸乙酯提取物中的蒽醌部分对缺血再灌注大鼠心肌有保护的作用，其原因可能是这部分保持了谷胱甘肽的抗氧化活性42。戴友平等发现，何首乌还能提高犬心肌缺血再灌注受损心肌中SOD、CAT的活性，明显减小心肌梗塞范围、降低梗死程度43。2.1.3 抗炎与免疫作用吕金胜等报道，何首乌乙醇提取物可明显抑制二甲苯所致的小鼠耳急性炎症肿胀和角叉菜胶所致的足跖肿胀，且维持时间较长；对醋酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性亢进及蛋清所致大鼠足肿胀有显著抑制作用；在醋酸所致小鼠扭体反应实验中发现，其还有一定的镇痛作用44。研究表明何首乌醇物和水提物均能不同程度地增加老年大鼠胸腺胞浆蛋白和核酸的含量，提高胸腺重/体重比值，促进胸腺细胞增生，延缓老年大鼠胸腺增龄性退化，从而提高老年机体胸腺依赖的免疫功能45。何首乌制剂还能对抗环磷酰胺的免疫抑制作用，使环磷酰胺引起的急性粒细胞减少提早恢复，保护胸腺细胞，这可能与其能改善胸腺微环境、促进胸腺细胞的分化和成熟有关46。何首乌的活性提取物大黄素和蒿属香豆素均剂量依赖地抑制人单核细胞对植物血凝素的反应和混合淋巴细胞反应，有一定的免疫抑制作用41。2.1.4 影响代谢的作用血和尿中的羟脯氨酸含量与年龄密切相关，可反应个体生长发育水平。白秀珍等对4、5月龄小鼠进行分组观察，发现何首乌制剂可显著降低小鼠血清中羟脯氨酸的含量，表明其具有促进生长发育，缩短幼年期的作用47。何首乌对血糖和脂肪动员也有调节作用，其水-醇提取物能降低C57BL/6J肥胖(ob/ob)小鼠血糖浓度，增加附睾脂肪层内葡萄糖的氧化，增强小鼠脂肪组织内激素敏感的脂肪酶活性，提高血浆脂肪酸和丙三醇水平48。另外，李丽春等报道，用何首乌明显降低大鼠摄食量和体重，且对大鼠肝脏脂肪酸合酶有很强的抑制作用，且明显强于已知抑制剂49。2.1.5 保肝作用生首乌和制首乌对四氯化碳、醋酸强的松和硫代乙酰胺引起的小鼠肝损伤后的肝脂蓄积均有一定的作用，且生首乌优于制首乌，这可能与生品中所含的结合性蒽醌类成分有关。由于结合性蒽醌的泻下作用，加速了动物体内毒物的代谢，使肝脂代谢途径得以恢复。制首乌则可增加肝糖元的积累，因此推断制首乌的补肝作用在于增加如肝糖元等化合物，而不在于修复肝细胞的损伤50。另外，何首乌醇提物和水提物均能显著提高老年大鼠肝脏胞浆蛋白含量和核RNA的含量，纠正肝脏核DNA含量异常，从而保护肝脏45。2.1.6 抗癌、抗诱变作用有学者对何首乌的不同溶剂提取物进行了抗癌活性筛选，发现其乙酸乙酯部分可对抗苯并芘的致癌作用，显著降低肿瘤的发生51。利用紫苏草微核分析法研究何首乌水提物的抗诱变活性，结果显示，何首乌给药组与对照组相比有抗染色体突变活性，此活性随给药浓度的降低而降低。何首乌的抗癌、抗诱变活性可能与何首乌的抗氧化、促进或彻底修复DNA的作用有关52。2.2虎杖的药理作用（摘自72）2.2.1对心血管系统的影响强心扩血管作用 100 g/L虎杖水煎液可明显增强蟾蜍离体心肌收缩。骆苏芳等53报道，01050145 mmol/L白藜芦醇苷显著提高大鼠及新生乳鼠心肌培养细胞搏动率，此作用可被尼索地平、普茶洛尔和酚妥拉明等阻断，提示作用机制可能与，受体及钙离子有关。虎杖的有效成分白藜芦醇苷具有显著的扩张血管，降低血压的作用。1.71 mmol/L白藜芦醇苷可非竞争性抑制去甲肾上腺素引发的家兔离体肺动脉收缩，使去甲肾上腺素量效曲线右移，但对肺动脉的舒张作用可被B受体阻断剂普茶洛尔减弱54。利用荧光染料及黏附式细胞仪观察虎杖苷对大鼠血管平滑肌细胞膜电位的影响发现，可使正常细胞膜去极化，作用机制可能与钠及钾通道开放有关，此过程亦可能被肾上腺素能及组织胺受体调节55。虎杖苷既能促进血管平滑肌细胞外钙离子进入细胞内，又能诱导细胞内钙离子释放。 抑制血小板聚集及抗血栓形成 0.610.4 mg/L白藜芦醇苷可明显抑制由ADP，AA及钙离子诱导的家兔血小板聚集，抑制TXB2的产生，对可乐定诱导的血小板聚集有显著的抑制作用，而对凝血酶诱导的血小板聚集的抑制作用则不明显，其机制可能与阻断血小板2受体有关56。白藜芦醇苷可使原代培养的人脐静脉内皮细胞释放前列环素，用0.15 mmol/L白藜芦醇作用10 min后，内皮细胞内6 ketoPGF1含量显著增加57。透射电子显微镜观察白藜芦醇处理后的兔血小板的超微结构变化发现，白藜芦醇苷对血小板的变形反应有明显的抑制作用，且呈量效关系58。 改善微循环及抗休克 白藜芦醇苷可明显抑制烧伤休克模型大鼠血浆内肿瘤坏死因子含量的升高，减轻白细胞的附壁黏着和肺部损伤，改善微循环59。白藜芦醇苷可延长重度失血性休克大鼠的存活时间，效果优于多巴胺60。 对呼吸系统的影响.1止咳作用 虎杖粗品及白藜芦醇苷(5g/kg)均有止咳作用，止咳率分别为47.6%，32.2%，大黄素亦具有一定的止咳作用61。.2 平喘作用 75 g/L虎杖煎剂作用于离体豚鼠气管可对抗组织胺引起的气管收缩，给药5 min后对抗强度为75%，虎杖煎剂具有一定的平喘作用61。 对消化系统的影响.1 对胃肠道的作用 给在体猫静脉滴注10 mg/kg大黄素可降低猫小肠肌张力，持续时间为3 min，随后肠管肌张力明显增强，收缩幅度亦增大，持续时间为20-30 min61。.2保肝利胆作用 虎杖所含蒽醌类物质可不同程度地降低肝损伤时血清ALT的水平，对过氧化脂质亦具有一定的清除能力，且对肝细胞具有保护作用62。洪照友等63报道，虎杖煎剂具有改善肝组织微循环，抑制白细胞及血小板与肝脏内皮细胞的黏附，促进肝细胞再生及修复作用。抗病原微生物作用.1 抗菌作用 虎杖所含大黄素10 g/kg、大黄素葡萄糖苷10 g/kg及白藜芦醇苷10 g/kg对金黄色葡萄球菌和肺炎双球菌具有抑制作用61。.2抗病毒作用 10g/L虎杖水煎液对单纯疱疹病毒及流行性感冒亚洲甲型京科681病毒具有抑制作用。30 g/kg虎杖煎剂对479号腺病毒、72号脊髓灰质炎II型病毒、44号埃可9型病毒、柯萨奇A 9型和B 5型病毒、乙型脑炎病毒及140号单纯疱疹病毒等7种病毒均有较强的抑制作用，且对HIV病毒亦具有一定的抑制作用64。抗肿瘤作用 虎杖所含大黄素对小鼠肉瘤S 180、肝癌、乳腺癌、艾氏腹水癌、淋巴肉瘤、黑色素瘤及大鼠瓦克癌等7种瘤株的增殖均有不同程度的抑制作用，抑制率均在30%以上。大黄素可抑制人早幼粒性白血病细胞的增殖，作用机制可能是抑制肿瘤细胞DNA的合成。【65摘自72】.抗氧化作用 实验结果表明，白藜芦醇苷对由自由基引发的脂质过氧化反应有抑制作用，且明显降低组织中的丙二醛含量，提高SOD，CAT，GSHPX的活性，对脑缺血及组织损伤有一定的保护作用66。 其他作用.1止血消炎 外用虎杖煎剂对烫伤及烧伤创面具有收敛、防止感染和消炎作用;内服虎杖煎剂对上消化道出血具有一定的止血作用，其活性成分为大黄素、大黄素葡萄糖苷、白藜芦醇及白藜芦醇苷64。.2对酶活性的抑制作用 利用含酪氨酸的血管紧张肽I作为底物，测定来自牛胸腺P56lck的PTKs发现，大黄素可抑制PTKs的活性，其IC50值为5mol/L55。.3对内分泌的影响 焦建杰等67报道大黄素可抑制白三烯B4的生物合成，但对前列腺素E 2的合成无抑制作用。王文俊等68报道，大黄素具有诱导单核细胞分泌肿瘤坏死因子和白细胞介素(IL)1，6，8的作用，且可抑制由内毒素诱导的上述细胞因子分泌，此外大黄素还可协同植物血凝素激活单核细胞分泌IL-1及干扰素。.4对基因表达的影响 姜晓峰等69报道，大黄素可抑制小鼠艾氏腹水癌细胞对3H-胸腺嘧啶核苷的跨膜转运，增强抗癌药物5-氟尿嘧啶丝裂霉素和氨甲蝶呤对人肝癌BEL-7402细胞毒作用，并可部分逆转人乳腺癌细胞MCF-T/Adr对阿霉素的抗药性。2.3大黄素-8-O-D-葡萄糖苷的研究进展大黄素-8-O-D-葡萄糖苷（emodin-8-O-D-glucopyranoside，EG）广泛存在于中药何首乌70、首乌藤71、大黄72、虎杖73等药用植物中。研究发现，EG具有促进智力的作用，且有在有效剂量范围内无毒性，故具有重要的研究和开发价值。2.3.1药理作用促智作用 陈万生等人研究发现，来源制何首乌的活性单体化合物EG具有促智活性，给正常小鼠和东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠ig EG后，以跳台实验及胆碱酯酶活力测定为标准，发现两组小鼠的跳台错误次数显著减少，离体实验和整体实验中EG对胆碱酯酶活力具有可逆性抑制作用，说明EG能提高正常小鼠学习记忆能力，并且对东莨菪碱所致的学习记忆障碍有防护作用，初步认为EG的作用机制是对胆碱酯酶的可逆性抑制74。2.3.2毒理作用 （摘自82的实验结果）王征等人通过急性毒性试验发现其实验的5个剂量组小鼠均未出现死亡,体重及行为与对照组相比无显著差异,解剖学研究也未发现异常,MTD为4.0g/kg体重,此剂量为药效学有效剂量的200倍,据此,可以认为两种晶型的PMEG用于促智在有效剂量范围内无毒性75。3 展望大黄素-8-O-D-葡萄糖苷（emodin-8-O-D-glucopyranoside，EG）广泛存在于中药何首乌70、虎杖73等药用植物中。研究发现，EG具有神经损伤保护、促智、改善睡眠、促成骨细胞增殖分化、降血脂、抗菌抗病毒、抗肿瘤等生理活性，具有重要的研究和开发价值。但是，EG在植物中含量普遍较低，且在提取过程中EG易水解成其苷元大黄素76，加上化合物本身难以合成等因素限制了对它的研究，迄今有关该化合物的研究综述未见报道。因此，有必要对EG的分离纯化工艺进行研究。第二部分 何首乌、虎杖中大黄素-8-O-D-葡萄糖苷的分离纯化研究第一章 前言何首乌是蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，我国大部分地区有出产。何首乌味苦、甘、涩，性微温，归肝、肾经，制用可补精益血，生用则有解毒、截疟、润肠通便之功。虎杖是蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc的干燥根茎及根。我国大部分地区均产，主产于江苏、江西、山东、四川等地。虎杖味苦，微寒，归肝、胆、肺经，有利湿退黄、清热解毒、散淤止痛、化痰止咳的功效。1其二者中含有的大黄素蒽醌类化合物具有抗肿瘤、消炎和抑菌等活性。大黄素-8-O-D-葡萄糖苷（emodin-8-O-D-glucopyranoside，EG）广泛存在于中药何首乌、首乌藤、大黄、虎杖等药用植物中。研究发现，EG具有促进智力的作用，且有在有效剂量范围内无毒性，故具有重要的研究和开发价值。课题组前期筛选何首乌提取物抗肿瘤作用部位时发现何首乌R50部位具有较好的抗肿瘤活性，且对正常肝实质细胞L02表现出低毒，进一步的研究发现，R50中具区别杀伤作用的主要成分为EG。而EG在植物中含量普遍较低，不易分离纯化，优化其分离纯化方法不仅能为进一步考察其抗肿瘤活性提供可靠样品，也可以为大量获取EG提供可行方案。本文通过大孔树脂柱、聚酰胺、硅胶等柱分离方法，从何首乌及虎杖中分离纯化大黄素-8-O-D-葡萄糖苷，并通过HPLC对其进行含量测定，从而探索何首乌及虎杖中大黄素-8-O-D-葡萄糖苷的制备工艺。何首乌依次经过大孔树脂、聚酰胺、两次的硅胶柱层析可以分离纯化出纯度较高的EG，成本低，易推广。虎杖依次经过乙酸乙酯萃取、聚酰胺柱层析可以分离出含EG含量较高的粗组分，且在HPLC检测中与杂质峰分离较好，后续可用硅胶柱层析继续分离，其分离纯化是可行的。第二章 正文1 实验材料1.1 药品何首乌，购自北京同仁堂药店，经鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根。虎杖，购自北京同仁堂药店，经鉴定为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc的干燥根茎及根。对照品：大黄素-8-O-D-葡萄糖苷（批号：120719），购自四川省维克奇生物科技有限公司。1.2试剂表1.实验试剂及耗材表名称规格来源乙醇95%北京化学试剂公司浓盐酸36.5%北京化学试剂公司氢氧化钠分析纯北京化学试剂公司大孔树脂AB-8北京化学试剂公司柱层析硅胶粉100-200/200-300目北京化学试剂公司聚酰胺柱层析硅胶60-90目北京化学试剂公司薄层硅胶层析粉G254北京化学试剂公司乙酸乙酯分析纯北京化学试剂公司甲醇分析纯北京化学试剂公司甲醇色谱纯美国 Fisher公司甲酸分析纯北京化学试剂公司甲酸色谱纯美国 Fisher公司纯净水596mL杭州娃哈哈集团有限公司1.3 实验仪器表2.实验仪器表名称型号来源色谱柱D*5cm北京青云立兴石英玻璃仪器旋转蒸发仪RE-52A上海亚荣生化仪器厂电子天平PB303-S北京Sartorius仪器有限公司电子分析天平TE612-LSartorius水浴锅HH-56金坛市正基仪器有限公司微孔滤器0.45m北京拜尔迪生物科技有限公司高效液相色谱仪Waters 1525美国 Waters公司高效液相色谱柱C18(2)5m 150*4.6mmDIAM0NSIL1.4 HPLC流动相配制 甲醇：色谱甲醇加入0.1%磷酸，混合均匀，经0.45微孔滤膜抽滤，得滤液，超声30min去除气泡，备用（现配现用）。水：纯净水经0.45微孔滤膜抽滤，得滤液，超声30min去除气泡，备用（现配现用）。2 实验方法及步骤2.1 何首乌和虎杖的提取方法中药提取常用的溶剂为乙醇和甲醇，其中乙醇又有无毒、残留小、价格较甲醇便宜等优点。通过前期实验证明，在何首乌和虎杖的70%乙醇提取物中含有较多大黄素-8-O-D-葡萄糖苷，故本实验决定采用70%乙醇作为何首乌和虎杖的提取溶剂。取何首乌药材1Kg，适当粉碎，加入5L圆底烧瓶中。向烧瓶中加入10倍体积的70%乙醇，回流加热至微沸，并在微沸状态下回流2小时，使用两层医用纱布过滤，收集滤液，继续向圆底烧瓶中加入10倍体积的70%乙醇，用同样方法微沸回流1.5小时，收集滤液。合并两次滤液后，在65下减压浓缩至2.5L，静置，挥去乙醇至无醇味，备用。取虎杖药材1Kg，提取方法与何首乌相同，浓缩得到2.5L提取液，备用。2.2何首乌和虎杖中EG的分离纯化方法2.2.1虎杖的乙酸乙酯萃取将500mL虎杖浓缩液加入2L分液漏斗中，再加入500mL乙酸乙酯。盖上分液漏斗，沿单个方向混匀，注意避免乳化。静置分层，将上层乙酸乙酯溶液倒出，再次向分液漏斗中加入500mL乙酸乙酯，操作与之前相同。重复6次，将各次萃取液合并，65下减压浓缩。萃取2次，得到1L虎杖提取液的萃取物，备用。2.2.2 何首乌的AB-8大孔树脂柱层析预处理：将大孔树脂于蒸馏水中浸泡,使其充分溶胀。使用4% NaOH，60水浴0.5h，蒸馏水洗至中性；再使用4% HCL，60水浴0.5h，蒸馏水洗至中性，杂质处理完成，备用。装柱：用棉花将柱底塞紧，将预处理后的AB-8大孔树脂较均匀地混悬于水中，装柱，待大孔树脂自然沉降后，最终柱体积为2.3L。上样：准确量取何首乌提取液，缓慢加入装有填料的柱子中，上样体积为柱体积的10%，打开柱底阀门使样品缓慢下降，待样品全部加入柱子后，加入少许水，静置吸附4小时。洗脱：洗脱剂依次为水、50%乙醇，95%乙醇，每次待洗脱部分颜色不变时更换洗脱剂直至结束。洗脱时，每300mL洗脱液在65下减压浓缩，并且硅胶G薄层层析与对照品EG进行点板跟踪。2.2.3 聚酰胺吸附树脂柱层析预处理：将聚酰胺粉于蒸馏水中浸泡,使其充分溶胀。使用4% NaOH，60水浴0.5h，蒸馏水洗至中性；再使用4% HCL，60水浴0.5h，蒸馏水洗至中性，杂质处理完成，备用。装柱：用棉花将柱底塞紧，颗粒状聚酰胺混悬于乙醇中，使其充分溶胀，装柱，待聚酰胺自然沉降后，最终柱体积为2.5L。上样：将样品溶解于水中，缓慢加入装有填料的柱子中，上样量为5%，打开阀门使样品缓慢下降，待样品全部加入柱子后，加入少许水，静置吸附过夜。洗脱：何首乌洗脱剂依次为水，60%乙醇，95%乙醇；虎杖洗脱剂依次为水、20%乙醇、40%乙醇。每次待洗脱部分颜色不变时更换洗脱剂直至结束。洗脱时，每100mL洗脱液在65下减压浓缩蒸干，再用少量甲醇溶出，并且每隔500mL使用硅胶G薄层层析与对照品EG进行点板跟踪。2.2.4 硅胶柱层析装柱：将柱底用棉花塞紧，称取50倍于上样量的200-300目柱层析硅胶，用漏斗将硅胶粉加入柱子，将硅胶粉压实。拌样：将何首乌样品溶解于甲醇，置于水浴锅上，取适量100-200目硅胶粉沿壁撒于液体上，随着溶液挥发，慢慢加入硅胶粉，直至样品被硅胶粉完全吸附，挥干溶剂。上样：将拌样加入装好的柱子中，压实，再加入少许200-300目硅胶粉。洗脱：开始时使用洗脱剂氯仿洗脱，洗脱至5个柱体积，换用洗脱剂氯仿：甲醇=5:1，直至馏分颜色不变。2.2.5 硅胶薄层层析硅胶G薄层板的制备：称取硅胶粉3.5g，量取0.1molL羧甲基纤维素钠溶液10mL放于研钵中，研磨至无明显颗粒由稀变稠（由硅胶G的质量或颗粒的粗细决定研磨的时间），抽滤，将滤液倒在10cm20cm玻璃板上，用研锤引导使之到边、快速轻微抖动玻璃板、铺平，将气泡引导至角上尽可能除去。风干。使用前在110烘箱活化30分钟。点样：取活化的硅胶板，在距底边1.5cm处，放一直尺。在直尺上从左向右标记各点、间距为0.7cm，将样品按顺序各点一次。点样后，用洗耳球吹干点样原点，使其湿痕迹刚刚消失为止。若再继续吹，造成样品干固，在展层时可能造成拖尾现象。展开剂：配置展开剂，展开剂配制比例如下：乙酸乙酯（v）：甲醇（v）：水（v）：甲酸（v）20：2：1：0.5，各溶液用移液管准确量取，直接放入干燥的层析缸内。由于展开剂较复杂，且样品点较多，故将薄层板的点样端放入层析缸内，不接触展开剂，预饱和5分钟。之后，不打开层析缸，轻轻将展开剂从层析缸内一侧倒入另一侧，注意切勿使点样的原点浸入展开剂中。检测：将经过展开剂展层的硅胶板从层析缸中拿出，在通风橱中用吹风机将展开剂吹干，将硅胶板放置在紫外成像仪中，使用312nm紫外灯下检测，调整摆放位置，光强、拍照。2.2.6 EG纯度检测取何首乌分离纯化物、虎杖分离纯化物、EG对照品，各溶于甲醇中使用0.45m微孔滤膜过滤，取样品溶液10 L，对照品溶液10L进样，流速1 mL/min，检测波长为280 nm，柱温：室温，流动相为甲醇：水：甲酸=70: 29.6：0.4。使用色谱柱为DIAM0NSIL C18(2)5m 150*4.6mm。3 分离纯化流程图3.1 何首乌的分离纯化流程3.2虎杖的分离纯化流程4 实验结果4.1.1何首乌EG分离纯化 何首乌提取液首先经AB-8大孔树脂柱层析吸附，经水洗脱去除杂质后，依次用50%乙醇、90%乙醇洗脱，使用硅胶G薄层层析（展开剂为乙酸乙酯（v）：甲醇（v）：水（v）：甲酸（v）20：2：1：0.5），硅胶板展开后放置在紫外成像仪中，312nm下检测，发现EG主要存在于50%乙醇洗脱部位，如图1所示：图1 TLC检测图:大孔树脂50%乙醇洗脱部位合并50%乙醇洗脱部位，50 旋蒸重新溶于甲醇中，进行聚酰胺柱层析。聚酰胺柱层析经水洗脱去除杂质，后用60%乙醇洗脱，使用硅胶G薄层层析（展开剂为乙酸乙酯（v）：甲醇（v）：水（v）：甲酸（v）20：2：1：0.5），硅胶板展开后放置在紫外成像仪中，312nm下检测，经TLC检测60%乙醇洗脱部位中含有EG，经60%乙醇洗脱后EG被富集完全，如图2所示：图2 TLC检测图: 聚酰胺60%乙醇洗脱部位将富集的EG经过两次硅胶柱层析，第一次硅胶柱层析后样品纯度提高，含有较少杂质，如图3所示。图4 TLC检测图：第一次硅胶柱层析产物，所标为EG标准品进一步使用硅胶柱层析纯化，样品中杂质被去除，得到纯的EG，如图3所示。2Kg何首乌经上述方法提取、分离、纯化得到23.56mg EG。图4 TLC检测图：第二次硅胶柱层析产物，所标为EG标准品4.1.2虎杖EG分离纯化 虎杖提取液首先经乙酸乙酯萃取，除去部分杂质，萃取液减压浓缩后进行聚酰胺柱层析吸附，经水洗脱去杂质后依次用20%乙醇、40%乙醇洗脱，使用硅胶G薄层层析（展开剂为乙酸乙酯（v）：甲醇（v）：水（v）：甲酸（v）20：2：1：0.5），硅胶板放置于紫外成像仪中，312nm下检测，经TLC追踪检测后发现EG主要存在于40%乙醇洗脱部位，如图5所示。图5 TLC检测图: 聚酰胺40%乙醇洗脱部位 TLC追踪检测40%乙醇洗脱部位，合并40%乙醇洗脱部位中含EG纯度较高部位，经过40%乙醇洗脱，除去较多杂质，如图6所示。图6 TLC检测图: 聚酰胺40%乙醇洗脱部位，所标为纯度较高的42流分4.2.1何首乌EG纯度检测将何首乌分离纯化物、EG对照品，各溶于甲醇，经 0.45m微孔滤膜过滤，取样品溶液10 L，对照品溶液10L进样，流速1 mL/min，检测波长为280 nm，柱温：室温，流动相为甲醇：水：甲酸=70: 29.6：0.4，色谱柱为DIAM0NSIL C18(2)5m 150*4.6mm。得到如图5所示结果：纯化得到的EG保留时间为3.347，与EG标准品的保留时间一致，纯化的EG中含有少量杂质，得到较高纯度的EG。4.2.2虎杖EG纯度检测将虎杖分离纯化物、EG对照品，各溶于甲醇，经 0.45m微孔滤膜过滤，取样品溶液10 L，对照品溶液10L进样，流速1 mL/min，检测波长为280 nm，柱温：室温，流动相为甲醇：水：甲酸=70: 29.6：0.4，色谱柱为DIAM0NSIL C18(2)5m 150*4.6mm。得到如图5所示结果：如图6所示，纯化得到的EG保留时间为3.338，与EG标准品的保留时间一致，纯化的EG中含有部分杂质，可进一步进行纯化分离。5 结论通过上述的分离纯化实验研究结果，可以得出以下结论：1. 何首乌依次经过大孔树脂、聚酰胺柱层析、两次的硅胶柱层析可以分离纯化出纯度较高的EG，分离方法重复性高，成本低，易推广。2. 虎杖依次经过乙酸乙酯萃取、聚酰胺柱层析可以分离出含EG含量较高的粗组分，且在HPLC检测中与杂质峰分离较好，后续可考虑使用硅胶柱层析继续分离，其分离纯化是有很大可行性的。6讨论 本论文主要是针对何首乌和虎杖中的EG进行分离纯化的基础研究，对提取分离的方法和条件进行了优化，新的方法易于推广，不受仪器限制，为后续抗肿瘤、益智等药理实验打下物质基础。参考文献1 高学敏.中药学M. 第二版.北京:中国中医药出版社, 2007: 465-466.2 Kryoshi Hata.A new stibene glucoside from Chinese crude drug “heshouwu”J.Yakugaku zassh,1975,95(2):211.3Nonaka Gi.Chemical composition of polygonum multiflorumJ.Phytochemistry,1982,21(2):459.4 李建北，林茂.何首乌化学成分的研究.中草药，1993，24（3）：115-118.5 Dexian Wang, Gengliang Yang, H.Engelhardt, et al. 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