课题3　血红蛋白的提取和分离.ppt

2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。,人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。,蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究,蛋白质分离的原理,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,（一）凝胶色谱法（分配色谱法）,2.凝胶：,大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法,1.概念：,3.凝胶色谱法分离蛋白质的原理,3.凝胶色谱法分离蛋白质的原理,【活学活用】1利用凝胶色谱法分离蛋白质时，蛋白质洗脱出来的顺序是()相对分子质量最大的相对分子质量最小的相对分子质量适中的A.B.C.D.,C,（二）电泳,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程,2.原理：,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。,1.原理：,2.聚丙烯酰胺凝胶：,丙烯酰胺+N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联的丙烯酰胺聚合体,蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率完全取决于分子大小，可用于测定蛋白质的分子量和蛋白质纯度鉴定。,原理：,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。,（三）缓冲溶液,1.作用:,2.缓冲溶液的配制:,3.本课题中使用的缓冲液:-磷酸缓冲液,成分：NaH2PO4与Na2HPO4,亚铁血红素基团,（一）血红蛋白,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,蛋白质提取和分离步骤,（二）操作过程,(1)红细胞的洗涤:,洗涤目的:,去除杂蛋白,洗涤操作：,1、采集血样2、低速短时间离心3、吸出血浆4、生理盐水洗涤红细胞液体5、低速短时间离心6、重复4、5步骤三次,1.样品处理,（二）操作过程,(2)血红蛋白的释放：,(3)分离血红蛋白溶液：,离心、分层：试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色)；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：,原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。目的：除去样品中分子量较小的杂质。,2.粗分离-透析,思考：为尽快达到理想透析效果，应如何操作？,增加缓冲液的量及时更换样品的缓冲液,（1）凝胶色谱柱的制作：,3.纯化-凝胶色谱操作,玻璃管直径大小不影响分离效果，但直径过大将造成洗脱液体积大，样品稀释度大。玻璃管高度与蛋白质的分离度有关。,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。“75”表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶色谱柱的装填：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：打开尼龙管，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,（2）凝胶色谱柱的装填,洗涤平衡：方法：目的-使凝胶装填紧密。注意：,50cm高,（2）凝胶色谱柱的装填,不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。,在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功,注意：,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,鉴定血红蛋白纯度。,目的：,1.样品的处理通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血