代谢控制育种PPT演示课件

第四节代谢调节控制育种,代谢调节控制育种是通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。,外因控制,培养调节,内因控制,突变体,1,2,一、组成型突变株的选育,组成型突变株是指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型。这两种突变株在工业上都可能得到应用，特别是在微生物酶制剂工业上。,Regulatorygene,repressor,NO,operator,repressor,NO,operator,3,筛选方法,1、限量诱导物法,突变株不需诱导物也能合成-半乳糖苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为能源和代谢原料，而迅速生长。野生型菌株因缺少诱导物和相应的诱导酶，不能利用乳糖而淘汰。,4,2、循环培养法,5,3、鉴别性培养基的应用,诱变后的孢子,以甘油为唯一碳源,原理：组成型菌株在没有诱导物的作用下仍能合成半乳糖苷酶，将无色试剂水解，放出O硝基苯酚。,6,4、筛选,将处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。例：-半乳糖苷酶组成突变株的筛选底物采用苯-半乳糖,7,二、抗分解调节突变株的选育,抗分解调节突变株：指抗分解阻遏和分解抑制的突变（一）解除碳源调节突变株的选育（二）解除氮源分解调节突变株的选育（三）解除磷酸盐调节突变株的选育选育有关抗分解调节的突变株，其实就是筛选合成酶产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，从而延长了产抗期而提高产量。,8,（一）解除碳源调节突变株的选育,在次级代谢中，高浓度的葡萄糖对青霉素转酰酶、链霉素转咪基酶和放线菌色素合成酶等抗生素的关键酶均有分解阻遏作用。在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合碳源可以控制中间代谢产物的积累，来减少不利影响。根本的解决办法是筛选抗碳源分解调节突变株。,9,筛选方法：1、循环培养法2、鉴别培养基喷ONPG，抗分解阻遏的菌落呈黄色，野生型是白色。3、特殊氮源组氨酸酶突变株葡萄糖+组氨酸分解代谢抑制物+唯一必须被分解的氮源,O-硝基苯酚-D-半乳糖苷,（一）解除碳源调节突变株的选育,突变株,野生株,有半乳糖酶,10,4、葡萄糖结构类似物,葡萄糖,2-脱氧葡萄糖,3O甲基葡萄糖,11,特性：1、结构与葡萄糖类似。2、不被微生物代谢，也不阻抑微生物生长。3、和葡萄糖一样会阻遏诱导酶的合成，其阻遏作用甚至比葡萄糖还要强。,12,筛选方法：,不含阻遏物,13,例如：桔林油脂酵母合成淀粉酶：玉米淀粉、酵母膏、蛋白胨及含有0.01%2dG的琼脂平板。木霉合成纤维素酶：含酸膨胀纤维素、蛋白胨、无机盐、胆汁、防菌扩展剂、2-dG的琼脂平板。,14,抗性突变株的性质,在2-dG或3-mG平板上生长的菌落接入斜面，对它们在含阻遏物和不含阻遏物培养基中的产酶能力比较，结果表明，大部分变株是抗分解阻遏突变型，并发现它们在去除阻遏物的培养基中酶活力往往高于野生型菌株。,含葡萄糖,不含葡萄糖,含淀粉,15,（二）解除氮源分解调节突变株的选育,次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶产量的一种有效方法。因为高浓度氨基酸会抑制芽孢的形成，并且阻遏蛋白酶的合成。,氨基酸1.5mg/ml水解蛋白10mg/ml,16,（三）磷酸盐对次级代谢的调节机制,1.通过初级代谢的变化影响次级代谢加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始。磷酸盐是许多初级代谢反应酶的效应物。2.改变糖类分解代谢途径：磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了戊糖途径的活力，导致以戊糖途径为先导的抗生素合成受抑制。例如：四环素、金霉素、土霉素、竹桃霉素,17,3.限制抗生素合成的诱导物甲硫氨酸是头孢霉素和磷霉素的诱导物色氨酸是麦角碱的诱导物，而磷酸盐是色氨酸合成酶等的抑制剂；4.抑制或阻遏磷酸酯酶类的合成链霉素、紫霉素、新霉素等生物合成中某些中间代谢产物需经磷酸化，因此从中间产物到终产物需由磷酸酯酶类，而磷酸盐抑制或阻遏磷酸酯酶的合成。例如磷酸盐明显抑制链霉素的生物合成通过抑制形成链霉胍的三步磷酸盐分解反应。,18,磷酸盐对ATP调节：cAMPATP例如：灰色链霉菌静息细胞研究磷酸盐对杀假丝菌素合成的影响。当加入10mol/L磷酸盐后，5minATP增加5倍，15min抗生素合成受抑制。发酵中磷酸盐浓度控制在亚适量水平。,19,解除（抗）磷酸盐调节突变株的选育,底部加浸润250mm/L磷酸盐的滤纸,灰色链霉菌,诱变后涂布于琼脂平板,含10mol/LNa3PO4,不含Na3PO4,脱敏感突变,敏感菌,20,三、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用,生物遗传学上：阐述代谢途径工业微生物代谢控制育种上：筛选到解除反馈的菌株。,21,（一）在初级代谢调节育种的应用,阻断代谢流或切断支路代谢，使代谢途径朝着有益产物合成方向进行。还可以通过营养缺陷型解除协同反馈效应，降低终产物的数量，以累积支路代谢中某一末端产物。,22,1、在直线式生物合成途径中,谷氨酸,N-乙酰谷氨酸,N-乙酰-谷氨酸磷酸,N-乙酰谷氨酸半醛,N-乙酰鸟氨酸,鸟氨酸,瓜氨酸,精氨酰琥珀酸,精氨酸,利用氨基酸缺陷型突变株进行鸟氨酸发酵,23,2、在分支生物合成途径中,生物素,脂肪酸,谷氨酸棒杆菌营养缺陷型产生L谷氨酸的生物合成途径,24,5-磷酸核糖焦磷酸,次黄嘌呤核苷酸,琥珀酸腺核苷酸,腺核苷酸,黄嘌呤核苷酸,鸟核苷酸,酶缺失,例：,谷氨酸棒杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸合成代谢途径,协同反馈,25,高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成途径,高丝氨酸脱氢酶,协同反馈抑制,DES,同工酶,26,（二）在次级代谢育种中的应用,丙二酰CoA,灰黄霉素四环素制霉菌素,脂肪酸,抗生素产量受脂肪酸代谢途径的影响,脂肪酸缺陷型,27,氯霉素产生菌初级代谢途径中的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸中的任何一个氨基酸发生营养缺陷突变，都会使氯霉素产量增加。营养缺陷菌株还可以产生新品种。金霉素第六个碳原子是由蛋氨酸供应，若获得蛋氨酸缺陷型，结果产生去甲基金霉素。四环素合成中，甲基化酶缺失，便形成了去甲基四环素。,28,例2,赤藓糖4磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸,莽草酸,预苯酸,L-苏对氨基苯丝氨酸,DAPH,分支酸,L-对氨基苯丙氨酸,氯霉素,酪氨酸,邻氨基苯甲酸,色氨酸,PABA,杀假丝菌素,苯丙氨酸,其它例子见p235,29,四、渗漏缺陷型在代谢调节育种的应用,渗漏缺陷型：遗传代谢障碍不完全的突变型特点：酶活力下降，但不完全丧失，能在基本培养基上少量生长。筛选方法：,营养缺陷型菌株,基本培养基,30,高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成途径,高丝氨酸脱氢酶,协同反馈抑制,高丝氨酸脱氢酶活力下降，没有完全丧失,31,五、抗反馈调节突变株的选育,抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。“抗反馈抑制突变型”“抗阻遏突变型”,Structuregene,product,Enzyme调节中心,NO,Regulatorygene,protein,product,NO,operator,32,在实际应用中，解除反抗调节可由以下方面：,从遗传上解除反馈调节各种抗性和耐性育种，回复突变子的应用截流或减少终产物堆积借助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型移去产物借助膜透性突变,33,抗反馈调节突变株获得途径,（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株（二）耐自身产物突变株选育（三）抗终产物结构类似物突变株的选育（四）累积前体和耐前体突变株的选育,34,（一）回复突变引起抗反馈调节突变株,正向突变：微生物从野生型经自然突变或人工诱变突变成有益突变型。回复突变：当具有突变型基因的个体通过再突变又变成野生型表型。,噬菌体敏感野生型,噬菌体抗性突变株,噬菌体敏感野生型表型,前后表型同，但实质有区别,35,1、回复突变的原因,（1）原有基因的回复突变（2）非原有基因的回复突变,原有基因位点消除,A基因,C基因,B基因,原有基因不同位点,不同基因不同位点,基因内抑制突变,真正回复突变,抑制基因突变,36,区别基因回复突变和抑制基因突变，可以将回复突变菌株和野生菌株进行回交试验或杂交重组试验来观察它们的子代是否有突变型出现：杂交结果有同样的突变型重新出现，说明回复突变和原来突变型不在同一座位上而是分开的，属于抑制回复突变。反之，如果杂交后代没有产生突变型，表明回复突变的座位与原突变型基因位点相同，是真正的回复突变。,37,回复突变的测定,回复突变常发生在遗传物质没有明显获得或缺失的点突变。,苏氨酸营养缺陷型,基本培养基,38,抗链霉素细菌的回复突变,依赖性突变株：抗链霉素突变株中有少数必须在有链霉素存在的时候才能生长。,诱变后的菌株,含链霉素,含链霉素,不含链霉素,含链霉素,不含链霉素,依赖性突变株,39,2、回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选,（1）初级代谢途径障碍性回复突变型,酶活力恢复，但调节中心已发生改变，不能与阻遏物结合，因此解除了反馈调节机制,40,5-磷酸核糖焦磷酸,次黄嘌呤核苷酸,琥珀酸腺核苷酸,腺核苷酸,酶活力恢复，调节中心改变,鸟核苷酸,酶缺失,例：,黄嘌呤核苷酸,41,（2）次级代谢途径障碍性回复突变抗生素回复突变株零变株：完全丧失产生抗生素的能力，但回复突变株的产量往往比亲株高。,例如金霉素、链霉素,42,一个共同的趋势：发生障碍性突变的营养缺陷型，抗生素产量都比亲株抵，而回复突变株往往比原养型亲株高。,营养缺陷型菌株中，几种不能合成的氨基酸与抗生素合成有关。基因突变的结果，使菌体丧失了合成这些氨基酸的某种酶的活力，导致抗生素产量下降。而回复突变导致合成氨基酸的酶的调节中心变化，氨基酸能大量合成。抗生素大量合成。,分析原因,氨基酸,抗生素,43,甲硫氨酸,金霉素,亮氨酸,缬氨酸,放线菌素,44,（二）耐自身产物突变株选育,自身产物：初级代谢产物次级代谢产物大多数抗生素都受本身的反馈调节，特别是氨基糖苷类抗生素。提高耐受性就意味着提高抗生素的产量。选育对抗生素不敏感、钝化酶活性高的菌株。筛选：涂布于含自身抗生素的平板上，逐级提高抗生素的浓度。,45,从土壤中筛选Aurdox,20-40mg/L,46,除耐受自身产物之外，还可以考虑与以下情况结合进行：1、抗Mg2+离子突变，根据以氨基糖苷类抗生素为材料的研究，Mg2+可提高产生菌的耐受性，以此设想筛选抗高浓度Mg2+的突变株，如卡那霉素、新霉素、链霉素等培养基中加入520mmol/LMg2+能显著提高产生菌自身耐受性。2、设想筛选高活性钝化酶的变株，其自身耐受性也会提高。,47,（三）抗终产物结构类似物突变株的选育,抗代谢结构类似物育种是最早采用并取得显著成效的代谢育种方法。从50年代以来在发酵工业上提高氨基酸、核苷酸、维生素产量已取得相当成效，成为当今初级代谢产物，尤其是氨基酸产生菌育种的主流。,48,1、结构类似物及性质,结构类似物：那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质性质：和变构酶的调节中心结合引起阻抑反馈。假反馈抑制：终产物与酶结合是可逆的。类似物不会掺入细胞结构，酶活性不会恢复。不像氨基酸那样掺入细胞结构，在细胞中的浓度不变。对微生物具有致死或抑菌作用。含结构类似物的培养基上，野生型菌株不能生长，抗结构类似物突变株能生长。解除机制对结构类似物或对终产物都是有效的,49,50,结构类似物的确定（p242）生长抑制试验和敏感性试验“筛子”的设计剂量的确定筛选的具体方法的确定高产株的检出,3、结构类似物抗性突变株的获得,51,抗性突变株的检出,突变株合成氨基酸,涂工具菌,突变株能够生长，野生型不生长,52,抗代谢类似物的筛选方法，一般采用浓度梯度法：,上层加入含异烟肼培养基下层不加含异烟肼培养基,浓度逐渐降低,高抗性菌落,敏感菌落,酵母生产吡多醇,53,2、较之营养缺陷型有如下优点,（1）如果能找到适当的结构类似物，用此种育种方法简单易行且效果显著；（2）采用营养缺陷型菌株发酵，解除代谢调节是通过控制培养基中所需的营养物质浓度来实现的，并没有从遗传上根本解除代谢调节。由于所需求的营养物质的量不易控制，往往使代谢产物不稳定，而抗结构类似物突变株的代谢调节被解除，生产操作方便，产量稳定；（3）抗结构类似物突变株易于保存，而且不发生回复突变，只要在保存培养基中加适量结构类似物，即可防止回复突变。,54,谷氨酸,N-乙酰谷氨酸,N-乙酰-谷氨酸磷酸,N-乙酰谷氨酸半醛,N-乙酰鸟氨酸,鸟氨酸,瓜氨酸,精氨酰琥珀酸,精氨酸,直线合成途径,结构类似物：刀豆氨酸2-噻唑丙氨酸D-精氨酸,19.6mg/mL,55,苏氨酸,分支合成途径,天冬酰胺,丙酮酸,异亮氨酸,天冬氨酸,天冬氨酸半醛,高丝氨酸,赖氨酸,天冬氨酸磷酸,蛋氨酸,结果：HD活性提高1300倍产量达14g/L虽有调节机制，但Thr优先合成，Lys处于低浓度。,2氨基乙基L半胱氨酸,乙硫氨酸,2氨基3羟基戊酸,56,举例,L-赖氨酸合成步骤,天冬氨酸激酶,2，3-二氢二羧酸合成酶,57,从上图可以看出，影响L-赖氨酸产量的因素表现在3个方面：一、L-赖氨酸和L-苏氨酸都会抑制天冬氨酸激酶二、L-亮氨酸会抑制2，3-二氢二羧酸合成酶三、赖氨酸合成需要消耗大量的丙酮酸，而丙酮酸也是丙氨酸、亮氨酸等多种氨基酸的共同前体，因此丙氨酸等生成可减少赖氨酸的合成。,58,育种过程：（1）在含有SAEC（硫代赖氨酸，为赖氨酸的结构类似物）的培养基上筛选出SAEC抗性的突变株，使菌株的天冬氨酸激酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸不敏感。为了进一步的提高产量，接下来还有多种选择：,59,其一、在SAEC抗性调节突变菌株基础上进一步筛选L-亮氨酸缺陷型突变株，解除L-亮氨酸的2，3-二氢二羧酸合成酶的抑制。其二、在SAEC抗性突变菌株基础上再进一步筛选出L-丙氨酸营养缺陷型菌株。其三，在SAEC抗性突变菌株基础上，选育对SAEC、-甲基-L-丙氨酸（L-丙氨酸类似物）和-氯代己内酰氨（L-亮氨酸的结构类似物）具有多重抗性的L-丙氨酸营养缺陷型菌株，则L-赖氨酸产量会提高更多,60,通过上述步骤，赖氨酸的产量变化如下：,61,5-磷酸核糖焦磷酸,次黄嘌呤核苷酸,琥珀酸腺核苷酸,腺核苷酸,鸟核苷酸,酶缺失,例：,黄嘌呤核苷酸,8氮鸟嘌呤,62,举例：S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）,SAM：是甲硫氨酸(Met)的活性形式。在动植物体内广泛存在，它是由底物L-甲硫氨酸和ATP经S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶促合成的。,63,细胞内存在两种S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶SAM1：其基因的转录在高浓度蛋氨酸存在下受到抑制SAM2：转录不受蛋氨酸的抑制据此，可大大提高SAM2在DNA的拷贝,64,（四）累积前体和耐前体突变株的选育,1、前体对抗生素生物合成的影响：（1）作为组成成分掺入生物合成（2）导致反馈调节（3）引