考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究

第23卷第3期2009年5月天津化工TIANJINCHEMICALINDUSTRYVOL_23NO3MAV2009考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究王孝平，邢树礼青岛科技大学药学系，山东青岛266042摘要采用考马斯亮蓝G250染色法对蛋白质含量进行了测定，建立了快速、灵敏的检测蛋白质的方法。结果表明，考马斯亮蓝G250染色法简单、迅速，且相对较为准确，是测定低浓度蛋白质含量的有效方法。关键词蛋白质；考马斯亮蓝；含量测定中图分类号R9272文献标志码A文章编号10081267200903004003在许多蛋白质研究的领域中。用一种快速准确的方法来检测蛋白浓度是必不可少的。一种新建立的考马斯亮蓝法在许多实验中已成为首选方法用来定量的检测蛋白浓度。与传统的LOWRY法相比，该法更易操作，更快，更灵敏，此外，它受其他一些试剂和非蛋白成分干扰也较小。该考马斯亮蓝法其检测原理是基于染料考马斯蓝G250和蛋白质之间形成的特异性结合。详细的研究表明【LJ。该染料可以自由存在于四种不同的离子形式中。相比之下，染料更多的阴离子形式与蛋白质结合且结合后显蓝色，在590NM左右具有最大吸收。因此通过定量测定染料的蓝色离子的量就可以算出蛋白质的量，这通常可以在595NM处测定吸光度获得。这种染料最容易与蛋白质中的精氨酰和赖氨酰键结合21，这种特异性可导致对不同的蛋白质检测时结果差异较大，这是此方法的主要缺陷。原考马斯亮蓝检测表明反应之间的不同的蛋白质会有较大变化。为了克服这个问题，发展并建立了几种改进的方法。1材料11试剂检濒临是100MG考马斯亮蓝G250溶于50ML95乙醇中。然后与100ML85磷酸混合，用蒸馏水稀释定容至1L。12标准蛋白质液以浓度为LMGML的牛一血清球蛋白在微量测定时浓度用100GML液作标准。为保证固体蛋白中的水分含量在贮藏过程中不会发生大的变化，平时应将该标准液放在一20的环境中储存。13塑胶制品及玻璃制品在利用分光光度计测量吸光度时所用的比色皿应该是塑料的或玻璃的。并且用之前应绝对保证清洗干洁，禁止使用石英成分为二氧化硅比色皿，因为染料会跟二氧化硅发生共价结合同。而染料粘到玻璃或塑料比色皿上时。可以用甲醇或洗涤剂清洗掉。2方法21标准测定方法211在小试管中依次按梯度加入100中含1O到100PG蛋白质。如果近似样本浓度是未知，可以测定一系列稀释品如1，110，1100，L1000。准备重复每个样品。2。12为校正曲线，取体积为L0，20，40，6O，80和100L的1MGML标准牛Y一球蛋白到小管中，蒸馏水补至100TXL。取100的蒸馏水作为空白试剂。213每管添加5ML蛋白质的试剂倒转或者摇动使其混合均匀。动作要轻以免产生泡沫，否则重现性会降低。214混合后2MIN到1H内以标准液为空白在595AM下测定样本的A值见注意事项32。100G标准在595RIM下的A值应在04左右。标准曲线不是直线，和精确的吸收不同，要看检测试剂的放置时间。因此，每套检测都要新建一个标准曲线。22微量测定方法这种形式的检测针对较为灵敏的蛋白质。因收稿日期20081208作者简介王孝平1982一，男，青岛科技大学硕士研究生。邢树礼1983一，男，青岛科技大学药剂学硕士研究生。第23卷第3期王孝平等考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究4L此当未知蛋白含量很少的时候是非常适用的。221在总量为100TRL到15ML聚乙烯微管中重复含有1到10G的样本。如果近似样本浓度是未知，可以测定一系列稀释品如1，110，1100，L1000等。2_2_2为校正曲线，取体积为1O，20，40，60，8O和100IXL的100GML的标准牛一球蛋白到微管中，并补蒸馏水至100LL。取100L的蒸馏水作为空白。2_23每管添加1ML蛋白质试剂，轻轻混合均匀。3注意事项31该考马斯亮蓝法是最常用的生化试剂测蛋白含量的方法里比较不受干扰的一种。但是，有少数的化学药品尤其是一些去污剂和两性电解质，其空白试剂或与蛋白染料反应后它们的吸光度可能会有显著改变见表1，这些物质可以用凝胶过滤，透析或磷酸钙沉淀蛋白质的方法从样品溶液中除去这也是目前测量蛋白质含量时集中存在的一个问题。表1一般反应物在考马斯亮蓝法中的影响32蛋白质与考马斯亮蓝G250的特异性结合可能会使这些蓝色染料的离子形式的最大吸收波长从590NM向620NM转移41，因此在测量前我们应该先确定在590NM至620AM之间有没有更大的吸收波长。不过，在通常的PH值下，为了简单起见，作为染料一蛋白复合物的折中我们经常以595NM作为测量波长。33该染料不与单体精氨酸、赖氨酸以及相对分子质量小于3000的多肽结合。许多肽类激素和其他一些重要的活性肽也在这一范围内，所以该考马斯亮蓝法不适用于对这些化合物的定量测定嘲。34这里描述的这种方法在检测不同种类的个别蛋白质时在灵敏度上会有差异。通常我们可以通过增加染料的浓度或增加溶液的PH值的方法来减小这一差异。例如，向反应物中加人NAOH以调整PH值来提高该方法的敏感度，结果大大降低了测量不同的蛋白质之间的差异。此外，这些改良后的方法对消除样品中去污剂的影响也是十分有效的。35不同来源或不同供应商提供的染料的纯度不同所以它们在考马斯亮蓝G250中的溶解度可能会有差异，但对于用该方法对常规蛋白质进行检测来说染料的质量不是特别的重要。因此对于染料质量所引起的差异这里不做讨论。3。6用来待测定的蛋白质和用来建构校准曲线的蛋白质应该用同一种。通常牛血清白蛋白BSA是常用的蛋白质标准品，因为它价格便宜而且质量也比较纯净。更重要的是可以将带测样品的测量结构直接与它的标准曲线进行比较。参考文献1ZUO，SSANDLUNDAHL，PAMICROBRADFORDMEMBRANEPROTEINASSAYJANALYTBIOCHEM，2005，2841621642SEDMAKDJANDGROSSBERG，SEARAPID，SENSITIVEANDVERSATILEASSAYFORPROTEINUSINGCOOMASSIEBRILLIANTBLUEG250【J】ANALYTBIOCHEM2005，795445523CHIAL，HJTHOMPSON，HB，ANDSPLITTGERBER，AGASPECTRALSTUDYOFTHECHARGEFORMSOFCOOMASSIEBLUEG250JANALYTBIOEHEM2003，2092582664KIRAZOV，LPVENKOV，LGANDKIRAZOV，EPCOMPARISONOFTHELOWRYANDTHEBRADFORDPROTEINASSAYSASAPPLIEDFORPROTEINESTIMATIONOFMEMBRANECONTAININGFRACTIONS【JANALYTBIOCHEM2005，20844485FRIENDENAUER,SANDBERLET，H_HSENSITIVITYANDVARIABILITYOFTHEBRADFORDPROTEINASSAYINTHEPRESENCEOFDETERGENTJ】SANYTBIOEHEM。2006，178263268第23卷第3期2009年5月天津化工TIANJINCHEMICALINDUSTRYV0123NO3MAY2009荧光黄法海水氯度测定的研究高红，齐景霞，李建云1天津渤海职业技术学院，天津300402；2石药集团恩必普药业有限公司，河北石家庄050000摘要实验采用荧光黄法测定海水中的氯度。实验中选用不同季节、不同深度的海水进行分析，得到景唐港海域盐度的分布及变化因素。其盐度变化总趋势为表层低，下层高。冬季表层盐度比其它季节高。关键词荧光黄法；海水盐度；海水氯度中图分类“TQ12441文献标志码A文章编号10081267200903004202本文根据海水常量成份的恒定性和氯度易于准确测定的特点，采用荧光黄法测定海水氯度1。再由氯度与盐度的经验关系式来计算盐度。1实验部分11仪器与试剂111水样的采集与贮存海水是一个复杂的多组分的多相体系水样的采取和贮存是极其关键的一步，本实验水样采自景唐港不同深度的海水贮存容器选用密封良好的渗透性低的高密度聚乙烯容器，并把不同深度水样贴上标签以视区别。实验中的标准海水氯度值为17。19D112仪器氯度滴定管；15ML移液管；150ML烧杯；50ML容量瓶；200ML海水样品瓶；500ML棕色试剂瓶；玻璃棒。113试剂析纯。1131硝酸银标准溶液硝酸银标准溶液的配制称取16GAGNO，置于500ML的烧杯中并用400ML蒸馏水溶解溶解后转移于棕色试剂瓶中备用。1132荧光黄钠盐指示剂101荧光黄钠盐溶液配制01MOLLNAOH溶液150ML，量取10ML将01G荧光黄溶于其中，并加01MOLL稀硝酸溶液中和到中性，然后用蒸馏水稀释到100ML，贮于棕色试剂瓶中。21淀粉溶液称取可溶性淀粉AR25G，先用少量蒸馏水调成糊状倒人250ML煮沸的蒸馏水中，冷却至室温。3荧光黄钠盐指示剂取01荧光黄钠盐溶液125ML与1淀粉溶液250ML混合；并加入025G苯甲酸钠，防止受霉菌的作用而腐败。试剂中除可溶性淀粉为化学纯外，其它均为分收稿日期2O081112DETERMINATIONOFPROTEINQUANTITATIONUSINGTHEMETHODOFCOOMASSIEBRILLIANTBLUEWANGXIAOPING，XINGSHUDEPARTMENTOFPHARMACY,QINGDAOUNIVERSITYOFSCIENCEANDTECHNOLOGY,SHANDONQINGDAO266042，CHINAABSTRACTTHEDETERMINATIONMETHODOFPROTEINCONTENTBYUSINGTHEDYINGMETHODWITHCOOMASSIEBRILLIANTBLUEG一250HAS