第四章-酶学分析技术PPT课件

.,1,第四章酶学分析技术,.,2,酶是生物体内活细胞合成的具有高效、特异催化作功能的蛋白质。,什么是酶enzyme?,目前将生物催化剂分为两类:蛋白质酶、核酶（脱氧核酶）,.,3,底物(substrate,S)：被催化的物质。产物(product,P)：反应生成的物质。酶促反应：酶催化的反应。酶活力：酶所具有的催化能力。,几个有关名词,丙氨酸,谷氨酸,.,4,常见酶类,丙氨酸氨基转移酶ALT或GPT乳酸脱氢酶（LDH）天冬氨酸氨基转移酶（AST或GOT）肌酸激酶（CK）5-核苷酸酶（5-NT)-羟丁酸脱氢酶（-HBD),.,5,一、酶活性,定义：酶活性（enzymeactivity）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。,表示方法：,或,式中v：反应速率，P：产物浓度，t：时间，S：底物浓度。,注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。,.,6,二、酶活性单位,（一）酶活性单位,定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。,表示方法：,惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间）国际单位IU（mol/min）Katal单位（mol/s）,.,7,1惯用单位：,20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位,ALP的金氏单位（King）氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）,特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。,卡门氏单位：1.0ml血清在25，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.8210-4molNADH为一个卡门氏单位,举例：,金氏单位：100ml血清ALP在37与底物作用15min，产生1mg酚。,.,8,2.国际单位IU（mol/min）,定义：在规定条件下（25及其他最适条件），每min催化1mol底物转变为产物的酶量，为1U，1U=1mol/min。,IFCC,2001年37,3Katal单位,定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的酶量。1Katal1mol/s。,IU与Katal单位的关系：1katal=60106U，1U=16.67nkatal,.,9,三、酶促反应动力学,以产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线）,.,10,（一）延滞期（lagphase、延迟期）,特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟,t1t2时间t图5-1酶促反应进程曲线,吸光度A,线性期,非线性期,R1,R2,延滞期,孵育期,延滞期,.,11,（二）线性期,此阶段酶促反应速率基本保持恒定；对底物而言，为反应速率与底物浓度S的零次方成正比的零级反应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比；,此时底物的消耗量小于5%，反应速率为反应初速率。酶活性浓度越高，线性期就越短,线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受的程度。线性度=前半段A/min后半段A/min/（前半段A/min后半段A/min）/2100线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于15，否则判为非线性,特点：可代表酶促反应速度,.,12,（三）非线性期（偏离线性期、平坦期）,进入非线性期的原因：,反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。,特点：,若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度S的一次方成正比，为一级反应。,.,13,偶联：工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。,工具酶：将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。,工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类,分类：,第二节酶学分析的类型,.,14,表7-2常用工具酶的名称及其缩写符号,名称缩写符号名称缩写符号,乳酸脱氢酶LDH苹果酸脱氢酶MDH6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD谷氨酸脱氢酶GLDH葡萄糖氧化酶GOD胆固醇氧化酶COD磷酸甘油氧化酶GPO过氧化物酶POD,己糖激酶HK肌酸激酶CK丙酮酸激酶PK甘油激酶GK脂蛋白脂肪酶LPL胆固醇酯酶CE脲酶肌酐酶,.,15,常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分转移酶类和水解酶类。工具酶的质量要求工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。,.,16,NAD(P)或NAD(P)H偶联的脱氢酶及指示反应，NADH和NADPH在340nm有光吸收特性，可用紫外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强烈荧光，其激发光波长为365nm，荧光波长为460nm，荧光法的灵敏度比分光光度法高。如ALT测定工具酶是LDH,.,17,二、酶活性的测定方法,测定方法分类：,按照仪器检测方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。,按照反应时间分类；分为定时法、连续监测法和平衡法。,按照检测对象分类：分为直接法和间接法。,.,18,1、定时法,原理：定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1t2）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。,特点：优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2）是否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。,定时法与两点法、终点法的区别,.,19,2.连续监测法（continuouemonitosing）每隔一定时间（1060s）连续测定酶反应中产物或底物的变化量称为连续监测法。又称动力法或速率法，终点法的测定两个时间点，该法进行多点连续测定。,.,20,优点：多点测定结果，连接成线，很容易找到成直线的区段，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，测定结果较准确。省时、省试剂。缺点：分光光度计必须有保温装置，而且P或S应是可直接测定的化合物，如需加入其他试剂则必须考虑它们对待测酶活性是否有影响。,.,21,3.平衡法（end-paintamalyin）测定酶反应开始后某一段时间内(从t1t2)产物或底物的总变化量称为终点法。而t1和t2是反应历程中的两个点，故又称两点法。,.,22,优点：简便，测定产物时，酶反应被终止，显色剂的选择只考虑对酶活性的影响，分光光度计不需保温装置。缺点：无法了解这段时间的反应是否都是零级反应，故难以保证结果的真实性。,.,23,计算公式:,产物的增加量每单位规定的保温时间1000（ml）酶单位/升=每单位规定的产物增加量实际保温时间实际标本用量（ml）,分光光度法测定的公式：,（A测定A对照）V总106每单位规定的保温时间酶单位/升=LV标实际保温时间,.,24,第三节影响酶活性测定的因素一、标本1.溶血RBC中某些酶活性比血高，如LDH高150倍，AST高15倍，ALT高7.5倍。2.抗凝剂某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA、草酸盐，可抑制需Ca2+的AMS和需Mg2+的CK、5NT、ALP等，酸酶活性测定都用血清。3.样品存放时间，各种血清酶稳定性不同，如ACP、CK在室温下迅速失活，AMS、GGT则很稳定。,.,25,二、测定条件的影响1.温度温度对酶活性的影响包括两个方面，一方面是温度升高，反应速度加快。另外一方面温度升高，会发生热变性，使酶活性降低。,.,26,（1）温度的选择37反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，25、30可使单位时间的散热较少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学较难定在30进行，IFCC建议30作为参考方法的标准温度。（2）温度系数将温度每升高10后反应速度相当于原来的倍数，称为温度系数(Q10)。Q10表示温度对反应速度影响的大小。,.,27,2.pH（1）改变底物的解离状态，影响酶与底物结合。（2）改变酶活性中心必需基因的解离状态，影响酶活性。（3）改变酶的三维空间构象，使酶变性。（4）使亚基解聚,.,28,3.缓冲液性质酶活性不仅受缓冲液pH影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液应考虑的因素。（1）缓冲液中弱酸的解离数pka必须接近酶测定时的Ph。如ALT测定pH7.4（磷酸pka6.7）LDH测定pH8.8，（二乙醇胺pka8.8）ALP测定pH10（碳酸pka10.32）。,.,29,（2）缓