山核桃外果皮中核桃酮热回流法提取的工艺条件

第29卷第1期2011年3月经济林研究NONWOLFORESTRESEARCHVO129NO1MAR2O11山核桃外果皮中核桃酮热回流法提取的工艺条件王晓燕，范成钢，杨伟。，李晋丽，张跃文，丁之恩1安徽农业大学，安徽合肥230036；2安徽省保险公司，安徽合肥230036；3中南林业科技大学，湖南长沙4100O4摘要为了更好地利用山核桃资源，提高产品的附加值，以山核桃外果皮中核桃酮的提取量为指标，采用单因素试验设计与正交试验法I3，就热回流法提取的工艺条件进行了试验研究。结果表明，最佳的热回流法提取下艺条件为以95的乙醇为最佳提取溶剂，提取2次；提取温度为8O，固液比为110，回流时间为60MIN。此提取工艺简单可行、稳定可靠，适用于核桃酮的大规模提取。关键词核桃酮；提取工艺；高效液相色谱法；热回流法；正交试验中图分类号TS25536文献标志码A文章编号10038981201101OO85O5REFLUXEXTRACTIONCONDITIONSOFREGIOLONEINCARYACATHAYENSISEPICARPSWANGXIAOYAN，FANCHENGGANGE，YANGWEI。，LIJINLI，ZHANGYUEWEN，DINGZHIEN1ANHUIAGRICULTURALUNIVERSITY，HEFEI230036，ANHUI，CHINA；2INSURANCECOMPANYOFANHUIPROVINCE，HEFEI230036，ANHUI，CHINA；3CENTRALSOUTHUNIVERSITYOFFORESTRYTECHNOLOGY，CHANGSHA410004，HUNAN，CHINAABSTRACTINORDERTOMAKEBETTERUSEOFCARYACATHAYENSISRESOURCESANDIMPROVEPRODUCTVALUEADDED，THEEXTRACTIONOFREGIOLONEINEPICARPSWASSTUDIEDBYHOTREFLUXMETHODONTHEBASISOFSINGLEFACTOREXPERIMENT，THERESULTSINDICATEDTHAT95ETHANOLWASTHEPREFERREDSOLVENTFORREGIOLONEEXTRACTIONANDEXTRACTTWICEENOUGHTHEOPTIMUMCONDITIONSOFORTHOGONALEXPERIMENTWEREASFOLLOWSTEMPERATURE8O，SOLIDANDLIQUIDRATIO110，EXTRACTINGTIME60MINTHEEXTRACTIONTECHNOLOGYFORREGIOLONEWASSCIENTIFIC，RATIONALANDCOULDBEUSEDININDUSTRIALPRODUCTIONKEYWORDSREGIOLONE；EXTRACTIONPROCESS；HPLC；REFLUX；ORTHOGONALEXPERIMENT近年来，随着山核桃CARYACATHAYENSISSARG价格的提高，发展山核桃的积极性空前高涨，山核桃外果皮等副产物随之大量增加。目前，绝大多数山核桃外果皮被当作废物而丢弃，既浪费资源又污染环境。山核桃外果皮与山核桃籽的质量之比达451O5510E，从废弃的外果皮中提取核桃酮，可有效开发利用山核桃资源，提高其附加值，变废为宝。有关文献L2记载，核桃酮对癌细胞HL60、HELA、HEPG具有明显的抑制作用，又能抑制脂多糖LPS和干扰IFN一了诱导的RAW2647大鼠巨噬细胞NO的生成_6。但是，有关核桃酮提取工艺的研究尚未见诸报道。为了实现山核桃的深度加工，开发天然抗氧化的核桃酮产品，采用微波收稿日期20101224基金项目国家自然科学基金项目“山核桃等经济林木生物活性物质的提取和悬浮培养研究”30271100。作者简介王晓燕1985一，女，江苏无锡人。硕士研究生，主要从事天然产物分离与鉴定的研究。TEEMAILWONGXIA0YAN333126COM。通讯作者丁之恩1956一，男，安徽肥东人。教授，博士研究生导师，主要从事经济林农产品加工和天然产物的研究。TEEMAILDINGZE08HOTMAILCOM。86王晓燕，等山核桃外果皮中核桃酮热回流法提取的工艺条件第1期法和超声法，就核桃酮的热回流法提取的工艺条件进行了试验研究，以期为高效提取核桃酮提供参考依据。1材料与仪器11原料与试剂供试的山核桃于2009年9月采自安徽省绩溪县。将阴干的山核桃外果皮经50真空干燥处理后粉碎，过6O目筛孔径025RAM。核桃酮标准品为实验室自制品，采用HPLC峰面积归一化法标定，纯度为981；甲醇色谱纯，美国TEDIA公司生产；乙腈色谱纯，美国TEDIA公司生产；乙酸色谱级，美国TEDIA公司生产；甲醇AR，无锡亚盛化工有限公司生产；食用酒精；乙酸乙酯AR，徐州试剂二厂生产。12仪器与设备高效液相色谱仪、2487紫外检测器及EMPOWER色谱工作站，美国WATERS600E型；电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司生产的DKS24型；数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司生产的KQ250DE型；微波炉，广东美的微波炉制造有限公司生产的KD23BDA型；天平，赛多利其科学仪器北京有限公司生产的BS124S型；离心机，上海安亭科学仪器厂生产的D25一B型；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂生产的RE52AA型。2试验方法21核桃酮的HPLC测定方法色谱条件口为色谱柱，PHENOMENEXLUNAC18250NMX46MM，5M；检测器，WATERS2489紫外检测器；检测波长为260NM；柱温为25。C；流速为LMLMIN；流动相A为乙腈，流动相B为2的乙酸水溶液，起始流动相为80B，至15MIN线性递减为30B。核桃酮标准曲线的测定方法为精确称取核桃酮标准品1MG置于50ML的容量瓶中，将甲醇色谱纯定容摇匀，即得浓度为20YGML的核桃酮标准溶液；用045M的有机滤头过滤，以续滤液为HPLC上样液；分别取5、10、20、40、80、160L的滤液进样；以峰面积Y为纵坐标、核桃酮含量X为横坐标进行线性回归分析。22热回流法提取核桃酮的试验设计单因素试验设计称取1020G原料置于圆底烧瓶中，进行热回流提取8，设提取溶剂、温度、料液比、时间、次数这5个因素进行单一因素试验保持其它因素均相同；将提取液离心3500RMIN一，15RAIN，取上清液，以HPLC法分析核桃酮含量。正交试验设计因素与水平_G如表1所示。为了避免因人为因素而导致的系统误差，试验中并没有按因素水平数值的大小顺序排列，而是采用了抽签的方法。表1正交试验设计的因素与水平TABLE1FACTORSANDLEVELSOFORTHOGONALEXPERIMENT3结果与分析31核桃酮的HPLC测定结果及方法学的验证311线性关系的试验结果将浓度为2OGML的核桃酮标准溶液分别以5、1O、2O、40、80、160UL即01、02、04、08、16、32G的核桃酮质量进样，进行线性关系考察，结果如图1所示。图1表明，在核桃酮含量为0132G的范围内，峰面积线性关系良好，得到的回归方程为Y一105753X一26536R。一09999核桃酮含量REGIOLONECONTENTG图1核桃酮质量X与峰面积Y的标准曲线FIG1STANDARDCLLREOFREGIOLONECONTENTANDPEAKAREA第29卷经济林研究87312精密度的试验结果精确配制浓度分别为5、10、20GML的核桃酮标准溶液，连续进样5次。按照211所述的色谱条件测定峰面积，计算所得的RSD值分别为179、184、145。这表明仪器精密度良好。313稳定性的试验结果精密吸取浓度为2OGMI_1的核桃酮标准溶液，分别于0、2、4、6、8、10H时进样。按照211所述的色谱条件测定峰面积，计算所得的RSD值为057OA。这说明核桃酮甲醇液室温下放置10H内品质稳定。314重现性的试验结果取正交试验的第2组样品条件，制备5份。按照211所述的色谱条件测定峰面积，计算所得的RSD值为103。这表明该方法的重现性良好。315加样回收率的试验结果取已知的核桃酮原料9份，每份各1G，分别按已知含量的50OA、100、150这3个水平加入核桃酮标准品，按照211所述的色谱条件测定峰面积，计算所得的平均回收率为1004，RSD值为194。32用热回流法提取核桃酮的单因素试验结果321不同提取溶剂的影响情况按照样品干粉质量的10倍料液比，分别加入甲醇、95乙醇、8O乙醇、乙酸乙酯，于5OC水浴中回流3次，每次05H，然后将3次回流所得的滤液混合。不同提取溶剂的提取效果如图2所示。由图2可知，95乙醇的提取率比甲醇的略低，但是从食用安全性方面考虑，选择95的乙醇比较稳妥。95乙醇的提取效果比8O乙醇的好，这说明核桃酮的极性并不太强，微溶于水。乙酸乙酯也能用于提取核桃酮，但从提取率及经济角度考虑均不理想。因此，核桃酮的最佳提取溶剂为95的乙醇。322不同提取温度的影响情况按照样品干粉质量的10倍料液比，加入95的乙醇，分别于5O、6O、70、8O、90、100水浴中回流3次，每次05H，然后将3次回流所得的滤液混合。不同提取温度的提取效果如图3所示。由图3可知，随着温度的升高，核桃酮的提取量随之增加，当温度达到80时，提取量最大，而温度继续升高提取量则减少。这是因为温度升高，分子运动速度加快，渗透扩散溶解速度加快，当温度达到8O【J醇95乙醇80乙薛乙酸乙酯提取溶剂EXTRACTIONREAGENT图2不同提取溶剂的提取效果FIG2EFFORTSOFREAGENTONREGIOLONECONTENTBYHOTREFLUXMETHOD时，乙醇迅速蒸发，所以核桃酮溶解度降低，这不利于提取；同时考虑到生产上的热耗问题，故提取温度以7080。C为宜。4504003500O0兰250200U1501005O0506O7O809O10O提取温度EXTRACTIONTEMPERATURE，1图3不同提取温度的提取效果FIG3EFFECTSOFEXTRACTIONTEMPERATUREONREGIOLONECONTENTBYHOTREFLUXMETHOD323不同料液比的影响情况按照样品干粉质量，加入不同料液比，ZV分别为16、110、114、118、122的95乙醇，于80水浴中回流3次，每次05H，然后将3次回流所得的滤液混合。不同料液比的提取效果如图4所示。由图4可知，以95乙醇为提取溶剂时，其用量对核桃酮的影响也很明显，用量越大，提取量也随之增加。其原因可能在于料液比影响核桃酮浸出液的浓度，从而影响了成分扩散的过程。但是，在料液比达到114时，即使再增加溶剂量，提取量也趋于稳定；过大的料液比会造成溶剂的浪费，并且给后续的浓缩和溶剂回收带来了困难。因此，选取的料液比宜为110114。湖啪O一一I一IIA苫8。LI】【L王晓燕，等山核桃外果皮中核桃酮热回流法提取的工艺条件第1期L6L10L14L18122料液比SOLIDLIQUIDRATIOMV图4不同料液比的提取效果4EFFECTSOFSOLIDLIQUIDRATIOONREGIOLONECONTENTBYHOTREFLUXMETHOD324不同提取时间的影响情况按照样品干粉质量的LO倍料液比，加人95的乙醇，于8O水浴中回流3次，每次提取时间分别为05、10、15、20、25、30H，然后将3次回流所得的滤液混合。不同提取时间的提取效果如图5所示。由图5可知，当提取时间在051OH的范围内，随着提取时间的延长，核桃酮的提取量较为明显地增加；若超过1H后，再延长提取时间，提取量的增加却并不明显。故实际操作中选取0510H的提取时间较好。0510L5202530提取时间EXTRACTIONTIMEH图5不同提取时间的提取效果FIG5EFFECTSOFEXTRACTIONTIMEONREGIOLONECONTENTBYHOTREFLUXMETHOD325不同提取次数的影响情况按照样品干粉重量的10倍料液比，加入95的乙醇，于8O水浴中回流，依次提取L、2、3、4、5次，总提取时间为5H。不同提取次数的提取效果如图6所示。由图6可知，增加提取次数确实可以增加提取量。但是，提取1次所得到的提取量已经可以达到提取5次所得总量的87左右，提取2、3、4次得到的提取量分别占提取总量的94、98、995。考虑到增加次数带来的能耗，故提取2次TR234提取次数EXTRATIONTIMES次图6不同提取次数的提取效果FIG6EFFECTSOFEXTRACTIONTIMESONREGIOLONECONTENTBYHOTREFLUXMETHOD33热回流法提取核桃酮的正交试验结果在单因素试验的基础上，选定95乙醇作为提取溶剂，提取次数为2次，对提取温度、料液比、提取时间进行L。3的正交试验，试验结果及分析见表2与表3。根据极差R的大小，可以判断各因素对试验指标影响的主次。直观分析结果见表2，比较各R值的大小，可见CAB空列，空列的极差极小，说明A与B不存在交互作用，即提取温度不需随料液比增大而增大。所以，试验因素对试验结果影响的主次顺序是CAB，即提取时间的影响最大，其次是提取温度，而料液比的影响较小。最优组合为A3B1C3即8O，14倍，60MIN，在此组合条件下得到的核桃酮含量为527GG_。由表3的方差分析结果可知，提取温度A和提取时间C对核桃酮的提取量均有显著的影响，所以，提取温度选择8O。C、提取时间为6ORAIN；料液比B无显著性差异。从节约试剂的角度考虑，优化后的最佳工艺条件为A。B2C3，即提取温度为8O。C，料液比为1O倍，提取时间为6OMIN。O0OO000OOOOOO0，骢如他可三二ULU。U。一。高0蛹如爱墨蜒姗铷枷瑚枷珊瑚如。一I一、LU磐口O。口D10口啦姐匿嚣伽枷姗湖珊瑚渤如。一嚣菪。IU8GIO1嘲姐匿誊蜒第29卷经济林研究89表2正交试验结果与分析TABLE2THERESULTSOFORTHOGONALEXPERIMENT方差来源平方和自由度均方和F值显著性VARIANCESOURCESSUMOFSQUARESDEGREEOFFREEDOMMEANSQUAREFVALUESIGNIFICANCE4结论1试验结果表明在色谱条件下、0132G的范围内，核桃酮含量与峰面积的线性关系良好，得到的回归方程为Y一105753X一26536R一09999，方法合理科学，可用作核桃酮的测定。2热回流法能应用于核桃酮的提取，1艺简单、稳定易行，适用于大规模生产。单因素试验及正交优化试验得到的热回流法提取核桃酮的最佳工艺条件为以95乙醇为提取溶剂，料液比110，在8OC温度条件下回流60MIN，重复2次。参考文献12334王国平，过婉珍山核桃蒲壳污染综合治理及其效应L_J现代农业科技，2006，1272南京中医药大学中药大辞典上册M第2版上海上海科学技术出版社，2006274张秀君核桃楸皮提取