生化分离工程5亲和纯化

5.亲和纯化,生物亲和作用亲和色谱膜亲和过滤法亲和双水相萃取亲和反胶团萃取亲和沉淀磁性亲和分离,5.1生物亲和作用,生物亲和作用的本质影响亲和作用的因素亲和作用体系,5.1.1生物亲和作用的本质,生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化（affinitypurification）。亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。,具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔”的空间结构关系。亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合：静电作用氢键疏水相互作用配位键弱共价键,图5-1蛋白质的结合部位及各种结合作用力,5.1.2影响亲和作用的因素,1.离子强度离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互作用等。2.pH-羧基的pKa3.43.8-羧基的pKa3.94.0-氨基的pKb7.47.5-氨基的pKb10.010.4,3.抑制氢键形成的物质脲和盐酸胍（guanidinohydrochloricacid）的存在可抑制氢键的形成。4.温度温度升高，静电作用、氢键及金属配位键减弱；疏水性相互作用增强。5.离液离子在SCN，I和ClO4等离液阴离子存在下，疏水相互作用降低。6.螯合剂,5.1.3亲和作用体系,将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物），使其从混合物中高选择性地分离纯化。一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand），用L表示。Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104108L/mol，最高可达到1015L/mol。,表5-1常用的亲和作用体系特异性亲和作用体系高特异性抗原-单克隆抗体荷尔蒙-受体蛋白核酸-互补碱基链段、核酸结合蛋白酶-底物、产物、抑制剂群特异性免疫球蛋白-A蛋白、G蛋白酶-辅酶凝集素-糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质-肝素酶、蛋白质-活性色素（染料）酶、蛋白质-过度金属离子酶、蛋白质-氨基酸（组氨酸等）,5.2亲和色谱,亲和色谱的特点选择性高、特异性极强操作条件温和回收率高亲和色谱的局限性普遍性、通用性不够费用高,5.2.1亲和色谱填料,亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的，需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附介质。少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴刀豆球蛋白A（一种植物凝集素）。在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的需要，有必要自制亲和吸附介质。,亲和配基1.酶的抑制剂小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸等。2.抗体利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱（immunoaffinitychromatography）。抗体与抗原之间的Keq一般为1071012L/mol。因此，利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。,3.A蛋白proteinA为分子量约42kD的蛋白质，与IgG具有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。,4.凝集素凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称。伴刀豆球蛋白A（concanavalinA，conA）可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。pH5.6时conA为二聚体，分子量为52kD；pH5.6时为四聚体，分子量为102kD，两个亚基（subunit）之间通过二硫键结合。因此，在利用conA为配基的亲和色谱操作中，操作条件应当适宜。,5.辅酶和磷酸腺苷脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有NAD（nicotinamideadeninedinucleotide）、NADP（NADphosphate）和ATP（adenosinetriphosphate）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。AMP（adenosine5-monophosphate）、ADP（adenosine2，5-diphosphate）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和配基。,6.三嗪类色素利用色素为配基的亲和色谱法又称色素亲和色谱（Dye-ligandaffinitychromatography）。Triazinedyes是一类分子内含有三嗪环的合成染料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模拟色素（biomimeticdye）。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、干扰素、核酸酶和糖解酶等具有很高的亲和力。CibacronBlueF3GA：,7.过渡金属离子Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为金属螯合色谱（metalchelatechromatography）或固定化金属离子亲和色谱（immobilizedmetalaffinitychromatography，IMAC）。,8.组氨酸组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质pI的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。,5.肝素肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5至30kD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低。,亲和色谱填料载体亲和色谱的理想载体应具有下列特性：不溶性；渗透性；高硬度及适当的颗粒形式；最低的吸附力；较好的化学稳定性；抗微生物和酶的侵蚀；亲水性；具有大量的供反应的化学基团。,常规的亲和色谱填料都是以软质凝胶，诸如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等作为载体材料的。近年来，为了满足快速高效分离的需要，以多孔硅胶和合成高分子化合物为载体的高效AFC色谱填料，得以迅速发展。亲和色谱填料的制备过程一般包括：载体（carrier、support）的选择、载体的活化和配基的连接。,部分商品化的色谱填料见表5-2。,表5-2部分商品化的色谱填料,载体的活化和配基的连接1.溴化腈活化法用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨基的配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）对多糖类载体的活化在碱性（pH10）条件下数分钟即可完成，之后的配基修饰亦需在碱性条件进行，一般使用碳酸盐缓冲液。反应过程为：,2.环氧基活化法可用于固定分子结构为R-NH2、R-OH和R-SH的配基。常用的活化试剂为1,4-丁二醇-二缩水甘油醚（BGE）和环氧氯丙烷。以活化羟基为例：或引入活性基团环氧基后，可采用下述直接法或间接法（氧化法、碳二亚胺法、戊二醛法）固定配基。,3.硅胶的活化活化硅胶常采用硅烷化试剂，如-氨丙基三甲（乙）氧硅烷和环氧丙基三甲基硅烷等，反应为：引入活性氨基或环氧基后，在酸性溶液中环氧基可发生二醇化反应：,4.间隔臂当配基较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基大分子不能发生有效的亲和吸附作用。这时，需要在配基与载体之间连接一个“间隔臂（spacer）”，使其发生有效的亲和结合。,图5-2间隔臂的作用,在上述配基固定化方法中，环氧基活化法中的双环氧化合物起间隔臂的作用。事实上，除CNBr活化法外，其他活化法都引入了不同的活性基因，这些活性基团如果有适当的长度，都可起到间隔臂的作用。利用CNBr活化法固定小分子配基时，一般需先引入-氨基已酸或1,6-二氨基已烷后再用相应的方法固定配基。引入间隔臂的长度是有一定限制的，当间隔臂超过一定长度时，配基与目标分子的亲和力又会减弱。,5.2.2亲和色谱洗脱方法,特异性洗脱法利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。例如：Lys和Arg均为t-PA的抑制剂，利用固定化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进行洗脱。,利用conA为配基的目标产物可用葡萄糖溶液洗脱。特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系（例如，用三嗪类色素为配基时）或非特异性吸附较严重的物系，特异性洗脱法有利于提高目标产物的纯度。,非特异性洗脱法非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。,8.2.3应用举例,1.t-PA的纯化组织纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种糖蛋白，具有激活纤溶酶原、促进血纤维蛋白溶解的作用，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋白药物。赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒和纤维蛋白与t-PA具有亲和结合作用，常用做亲和色谱纯化t-PA的配基。图5-3是利用精氨酸-Sepharose4B亲和色谱法纯化猪心组织t-PA的结果。原料为猪心丙酮粉经醋酸钾抽提、硫酸铵沉淀。,图5-3精氨酸-Sepharose4B亲和色谱,2.干扰素的纯化干扰素（interferon，IFN）对癌症、肝炎等疾病具有特殊疗效。IFN主要分、和三种类型，可通过动物细胞培养或重组DNA大肠杆菌发酵大量生产。色素亲和色谱、固定化金属离子亲和色谱和免疫亲和色谱可用于IFN的纯化。如图5-3是利用单抗免疫亲和色谱法纯化源于大肠杆菌的重组人白细胞干扰素（rhIFN-）的操作条件和结果。rhIFN-的比活提高了1150倍，收率达95。,图5-4单抗免疫亲和色谱法纯化rhIFN-,5.3膜亲和过滤法,自20世纪80年代中期以来，把亲和色谱技术和膜分离技术两种技术有机地结合，出现了膜亲和过滤方法。膜亲和过滤方法包括两个分支：亲和膜分离技术亲和错流过滤,5.3.1亲和膜分离,原理和特点亲和膜（affinitymembrane）是利用亲和配基修饰的膜。亲和膜分离是以亲和膜为亲和吸附介质纯化目标产物的分离方法，是亲和色谱的变型。又称膜亲和色谱（membrane-basedaffinitychromatography）。,亲和色谱操作速度有限。一般采用径向放大的方式，才能保证色谱柱的处理量。如果色谱柱的体积一定，降低柱高而增大柱径可即“短粗”型亲和色谱柱有利于提高分离速度。,亲和配基固定在膜孔表面，流体在对流透过膜的过程中目标蛋白质与配基接触而被吸附。,图5-5亲和膜吸附原理示意图,应用举例色素亲和膜纯化G6PDH：在9min内即完成了0.6L料液的纯化处理，G6PDH收率达82，比活提高27倍。,图5-6色素亲和膜纯化G6PDH,5.3.2亲和错流过滤,原理和特点亲和错流过滤（affinitycross-flowfiltration，ACFF）又称亲和过滤（affinityfiltration）或亲和超滤（affinityultrafiltration），是生物亲和相互作用与膜分离相结合的生物大分子的分离纯化技术。,亲和过滤操作,图5-7亲和过滤操作,亲和过滤的优点以压差为传质推动力，速度快，易于放大；纯化水平可接近或达到亲和色谱；制备亲和过滤介质所用的载体一般为水溶性聚合物或无孔微粒，无内扩散传质阻力，目标分子的亲和结合速度快；与固定床型亲和色谱相比，亲和过滤操作中目标分子与亲和过滤介质的接触在全混槽中进行，最多只能达到一级吸附平衡，相当于色谱过程的一个理论塔板。采用多级串联亲和过滤操作可弥补这一缺点。,应用举例利用高温杀死的酵母细胞为亲和过滤介质进行亲和过滤纯化conA的研究。酵母细胞（直径约5m）表面含有多糖残基，因此可亲和吸附conA。利用中空纤维膜组件的间歇亲和过滤流程示于图5-8.,0,图5-8中空纤维膜组件的亲和过滤流程,5.4亲和双水相萃取,亲和双水相萃取即在PEG或Dextran上接上一定的亲和配基，这样使体系具有双水相处理量大和亲和色谱专一性高的优点。随着亲和双水相萃取体系的完善，更显示出其在生物物质分离中的独特优点。,近几年来，仅在PEG上可接的配基就有十多种，分离纯化的物质达几十种，产物的分配系数成百上千倍的提高，如用磷酸酯PEG磷酸盐双水相体系萃取-干扰素，分配系数由原来的1左右提高到630。,5.5亲和反胶团萃取,亲和反胶团萃取（affinity-basedreversedmicellarextraction）是指在反胶团相中除通常的表面活性剂（如AOT）以外，添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂（cosurfactant），通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性的分离方法。,图5-9亲和反胶团萃取conA,利用正辛基-D-吡喃葡萄糖苷（octyl-D-glucopyranoside，OGP）提高conA的萃取率,5.6亲和沉淀,亲和沉淀（affinityprecipitation）是生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术。亲和沉淀又分一次作用亲和沉淀二次作用亲和沉淀,5.6.1一次作用亲和沉淀,水溶性化合物分子上偶联双配基（bis-ligand）或多配基（polyligand）与多价蛋白质（multivalentprotein）产生亲和交联而沉淀的分离方法称为一次作用亲和沉淀（primary-effectaffinityprecipitation）。一次作用亲和沉淀机理与抗原-抗体的沉淀作用相似，当配基与蛋白质的亲和结合部位的摩尔比为1时沉淀率最高。,1979年Larsson和Mosbach发表了利用双辅酶（bis-NAD）亲和沉淀乳酸脱氢酶（LDH）的研究。1983年，利用三嗪色素（ProcionBlueH-B）为配基的一次作用亲和沉淀法纯化免肌LDH，收率达97，纯度达电泳纯。一次作用亲和沉淀仅适用于多价蛋白质，要求配基与目标分子的亲和结合常数较高，沉淀条件难于掌握，并且沉淀的目标分子与双配基的分离困难，实用上存在较大难度。,5.6.2二次作用亲和沉淀,利用在物理场（如pH、离子强度、温度和添加金属金子等）改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质。亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀（secondary-effectaffinityprecipitation）。,早期开发的可逆沉淀性亲和载体分子结构如下。其中的苄脒基为胰蛋白酶的亲和配基，而苯甲酸基为pH敏感基团。该聚合物可溶解于pH6的水溶液，但当pH5时即可发生完全的沉淀。,例牛胰蛋白酶的纯化将该聚合物加入到pH8.0的牛胰抽提液中，充分混合。加酸使pH值降至4.0，则聚合物与胰蛋白酶结合沉淀。离心回收沉淀，并用pH4.0的水