治疗高侵袭性胃癌的临床实践

分类号：密级：UDC：编号：学 位 论 文论文题目治疗高侵袭性胃癌的临床实践英文题目姓名指导教师姓名 申请学位级别 专业名称 提交论文日期论文答辩日期学位授予单位和日期 答辩委员会主席评 阅 人年 月学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名：日 期： 学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交中国博士学位论文全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国学位论文全文数据库中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入CNKI中国知识资源总库，在中国博硕士学位论文评价数据库中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名： 导师签名： 日期： 日期：中文摘要目的通过体外实验观察紫杉醇联合恩度对高侵袭胃癌细胞生长的影响，同时观察两药间是否具有协同增效作用，并进一步研究其作用机制，为紫杉醇联合恩度治疗高侵袭性胃癌的临床实践提供可靠的实验室依据。方法（1）体外培养人胃癌MGC803细胞，采用MTT法检测紫杉醇和恩度单药在不同浓度和作用时间下对MGC803细胞的增殖抑制作用，绘制浓度-生长抑制曲线图，计算半数抑制浓度（IC50）。用已确定的最佳剂量组合单独或联合治疗胃癌细胞MGC803，分为4组：对照组、紫杉醇组、恩度组、两药联合组。（2）采用MMT法检测紫杉醇和恩度单药及两药联合作用对胃癌细胞的增殖抑制作用；分别通过计算两药相互作用系数（CDI）评价两药在不同组合的相互作用性质。（3）通过Annexin-V FITC/PI双标记染色法检测各实验组细胞对细胞系凋亡的影响。（4）采用Transwell小室法检测各实验组胃癌细胞的侵袭情况；（5）ELISA法检测紫杉醇和不同浓度恩度单药以及两药联合处理24h后MGC803细胞上清液中VEGF和MMP-2的水平。（6）运用Western Blot检测紫杉醇和不同浓度恩度单药以及两药联合处理24h后MGC803细胞中VEGF、MMP-2以及MMP-9的表达影响。结果（1）恩度和紫杉醇对胃癌MGC803细胞具有增殖抑制作用，在紫杉醇单药组和联合组中，观察到时间和剂量依赖性，恩度单药组中仅发现剂量依赖性特征。（2）恩度和紫杉醇均能够促进胃癌细胞凋亡，且联合用药组作用最强，且具有剂量依赖性。（3）恩度和紫杉醇均能够减弱细胞侵袭能力，呈剂量依赖性，联合用药组作用最强，呈相加效应。（4）恩度和紫杉醇均能够下调MGC803细胞上清液中VEGF、MMP-2细胞因子的表达水平，两者联合应用后可增强该作用。（5）恩度和紫杉醇可抑制细胞中VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白的表达，两者联合应用后抑制作用增强。结论体外实验证明，恩度联合紫杉醇可抑制MGC803的增殖和侵袭能力，同时诱导细胞凋亡效应，且作用具有相加效应。经不同浓度恩度处理后的MGC803穿过重建基底膜的能力明显降低，呈剂量依赖性，提示恩度联合化疗药物能显著降低胃癌细胞的侵袭转移能力。通过ELISA法观察到恩度和紫杉醇均能够下调细胞上清液中VEGF、MMP-2细胞因子的表达水平，联合作用更强。同时蛋白印迹法检测到用药组与对照组相比，VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白表达明显下调，且随着恩度用药浓度的增加，各蛋白表达量下降越多，同时MGC803细胞的侵袭转移能力减弱越明显。推测恩度可能通过阻断信号通路中的VEGF、MMP-2以及MMP-9的表达，发挥抗血管生成作用，从而抑制肿瘤侵袭、转移的发生。关键词：重组人血管内皮抑素；紫杉醇；胃癌；增殖；凋亡；侵袭；细胞因子；蛋白表达AbstractObjectiveThis study aimed to observe the effect of combined application of endostar and paclitaxel on growth of gastric cancer cell lines. And by this research to verify the treatment efficacy and explore the further mechanism, which may provide theoretical basic for the application in clinic. Methods(1)Human gastric carcinoma MGC803 cells were used as in vitro, The anti-proliferation activities of endostar and paclitaxel single-agent in different concentrations and times were detected via MTT assay, and determine the optimal dose. Gastric carcinoma MGC803 cells was divided into four groups: control group, paclitaxel groups, endostar groups and combination groups.(2) MMT assay was used to examine the inhibition rate of cell growth when cells were treated at various concentrations of endostar and paclitaxel alone or in combination. Then the coefficient of drug in interaction (CDI) was used as a quantitative measure of the degree of interaction between different drugs. (3) Annexin V FITC/PI double marking staining method to detect the characteristics of cell apoptosis.(4)Invasion ability was examined by Transwell assay. (5) The level of VEGF and MMP-2 were detected by ELISA assay. (6)The protein expressions of VEGF，MMP-2 and MMP-9 were examined by Western blot.Result(1) Endostar or paclitaxel effectively inhibited the growth of MGC803 cells, paclitaxel groups and combination groups observed the concentration and time dependent manner, however, endostar groups only observed the concentration dependent manner. (2) Endostar and paclitaxel effectively promote MGC803 cells apoptosis in a concentration-dependent manner and the effects were enhanced when they combined. (3) Endostar and paclitaxel effectively inhibited the invasion ability of MGC803 cells in a concentration-dependent manner. and the role of inhibition in combination groups is obvious.(4) The level of VEGF and MMP-2 expression were reduced in paclitaxel and endostar groups, and the decrease was more obvious in combination groups.(5) Compared with control group, the VEGF,MMP-2 and MMP-9 protein expression was decreased in experimental groups, and the reduction was more obvious when they combined.ConclusionIn vitro experiment, endostar combine with paclitaxel inhibited the proliferation and invasion ability of MGC803, at the same time, inducted gastric carcinoma MGC803 cells apoptosis in complementary relationship. Endostar significantly reduced the ability of MGC803 through the reconstruction basement membrane in the concentration dependent manner. The level of VEGF and MMP-2 expression were reduced in paclitaxel and endostar groups, and the decrease was more obvious in combination groups. This two drugs also decreased the level of VEGF, MMP-2 and MMP-9 protein expression, and the reduction was more obvious when they combined. With the increase of drugs concentration, the level of cytokines and protein more decreased, and the invasion and metastasis ability of MGC803 cells more reduced. Endostar combined with paclitaxel can suppress the invasion of MGC803 cells and decreasing VEGF, MMP-2 and MMP-9 expression may be the related mechanism.Key word: Endostar; paclitaxel; gastric cancer；proliferation；apoptosis；invasion；cytokines；protein expression前言1.胃癌的发生率和死亡率高，且缺乏有效的治疗手段胃癌是全世界发病率和死亡率居高不下的恶性肿瘤之一, 其在全球每年新发病例高达989600例，占所有恶性肿瘤患者的8%；同时每年约有738000人死于胃癌，占所有肿瘤死亡人数的10%1。胃癌的发生呈现明显的地域特点,包括我国在内的东亚地区是胃癌的高发区域，发病率及死亡率一直处于较高水平，中国胃癌的发病和死亡病例均达到世界病例近半数，最新资料显示2003-2007年中国胃癌发病率为33.14/10万，占各类新发恶性肿瘤的第二位，死亡率为24.34/10万，占癌症死亡的第三为2，且近年来呈上升趋势。胃癌的发病原因为多种因素综合作用的结果，胃幽门螺杆菌是导致癌症的主要危险因子，胃部疾病如消化性溃疡、慢性胃炎、胃息肉，都可能发生癌变，除此之外，饮食、地理环境、真菌、血吸虫病及遗传因素等，与胃癌的发病有一定的关联3。胃癌早期无特异性症状，多数患者就诊时已属局部进展期甚至晚期，预后较差。晚期患者常伴有上腹部疼痛，恶心、呕吐，食欲减退，消瘦，呕血和黑便等症状，严重影响患者的生活质量。 手术治疗是目前胃癌根治性治疗的主要方式，但是对于可切除的局部进展期胃癌患者，即使行根治性切除术，整体预后仍不佳。国内资料显示，行标准的D2根治术后，I期、II期和III期患者的5年生存率分别为93.2%、72.4%和39.1%，IV 期患者仅为5.2%4。影响术后病人预后的主要因素是肿瘤转移的发生。胃癌发生转移的主要途径有淋巴结转移、腹膜种植转移和血行转移。远处转移一旦出现，中位生存期仅有5-7个月，早年以氟尿嘧啶、顺铂为主的联合化疗显示出延长生存的疗效；90年代新的化疗药物如紫杉类等进一步提高了晚期胃癌的生存期，但疗效终究有限。随着人们对胃癌分子生物学、分子病理学研究的深入，胃癌的靶向治疗或者化疗联合靶向治疗开始应用于临床或进入临床研究中，给晚期胃癌的综合治疗带来一丝曙光。2 紫杉类作为微管靶向细胞毒药物，为晚期胃癌患者带来生存受益紫杉类作为一种新兴的抗肿瘤药物，近年来在临床化疗中的应用越来越广泛，在非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌及胃肠道肿瘤的治疗中获得了可观的疗效。目前在临床广泛应用的药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇等。主要通过以下几条途径发挥抗肿瘤作用：1、与微管蛋白结合，影响微管蛋白二聚体与微管间的动态平衡，促进微管蛋白组装成微管，并使已组装的微管凝结、聚集，阻滞其解聚成亚单位，使细胞停滞于G2/M期5,6；2、能够诱导TNF-的表达、下调胞浆抑制性卡巴蛋白（IKB-）水平，激活NF-KB并促进其转移至细胞核参与调控下游基因7；3、可激活或调节多种凋亡相关基因或蛋白的表达，如Bcl家族、P53、P21、Fas/Fas配体及半胱天冬酶（Caspase）家族等，从而诱导细胞出现典型的凋亡形态学改变8,9。4、紫杉类可通过Raf-1激酶依赖的信号途径诱发自体吞噬泡形成，这也可能是诱导细胞凋亡的另一途径。但相对紫杉类诱导的细胞凋亡，其细胞凋亡作用可能位居其次10。另外,研究还显示紫杉醇有一定的抗血管形成作用11,特别是低剂量时可抑制血管内皮细胞管道形成12，临床上观察到降低血循环中VEGF浓度的作用13，在肿瘤的治疗中发挥独特作用。早在紫杉类进入临床的上世纪90年代，我们即试用紫杉类治疗晚期胃癌14。2004年一项III期临床研究证实多西紫杉醇联合顺铂、5-Fu（DCF）方案与CF方案相比能够明显延长患者生存时间15。我国采用改良的DCF方案（用卡培他滨和奥沙利铂代替氟尿嘧啶和顺铂）获得明显的临床疗效，且患者耐受性良好16。紫杉醇与多西紫杉醇一样表现出良好的临床疗效，国外研究显示紫杉醇联合氟尿嘧啶治疗胃癌较多西他赛联合氟尿嘧啶的疗效及生存期方面差异无统计学意义，且患者对紫杉醇联合方案的耐受性较好，具有更好的生活质量17。荟萃分析显示含紫杉类的三药方案作为胃癌的一线治疗明显优于未含紫杉类的两药或三药方案18。另外，紫杉类在晚期胃癌的解救性治疗中也发挥较好的作用。紫杉醇单药用于以氟尿嘧啶为基础的一线治疗失败后的二线治疗，有效率为24.2%，mPFS4.2个月，中位OS约8个月19。一项多中心的II期临床研究20，紫杉醇联合化疗治疗晚期胃癌患者总有效率达63.5%，中位PFS和OS分别为8.0和15.0个月。Hara等21报道了46例胃癌患者一线或二线接受紫杉醇联合方案治疗，肿瘤缓解率为56%，中位PFS和OS达5.3和18.1个月。对于营养摄入不足，伴有肠管狭窄、腹水的患者，紫杉醇联合方案治疗也能够获得较为理想的疗效：一线治疗的ORR是44.4%，mPFS为6.2个月，mOS为9.5个月；二线治疗的ORR为42.9%，mPFS和mOS为4.2和8.0个月22。随机对照III期临床研究进一步确立了紫杉类作为晚期胃癌二线或三线治疗的地位19。根据以上各项研究发现，紫杉类不论单药还是联合其他化疗药物，无论是用于一线治疗还是多线治疗，均对晚期胃癌具有良好疗效，是晚期胃癌的主要药物之一。但是,晚期胃癌患者即使采用紫杉醇为主的方案进行治疗,其中位生存期仍然徘徊在9-11个月左右。晚期胃癌的化疗遭遇瓶颈。3、胃癌的发生、发展及转移依赖于血管形成通路的激活。肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的基础，肿瘤的发生、发展不仅依赖于肿瘤细胞的增殖，与肿瘤新生血管形成密切关联。肿瘤血管生成是一个多因素参与的复杂过程，包括内皮细胞的增殖和迁移、血管内皮基底膜的降解，同时有血管生成促进因子、血管生成抑制因子、粘附分子、蛋白水解酶（MMPs）等因子的参与。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一个关键的血管生成刺激因子，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E等，其中VEGF-A是最主要的血管生长因子，通过与相应受体结合增加血管通透性、促进内皮细胞分裂及细胞侵袭作用；VEGF-C和VEGF-D通过与受体结合，促使淋巴管生成，诱导淋巴结转移发生。研究证实，VEGF表达的强弱与胃癌的预后密切相关23。胃癌患者血清VEGF表达量明显高于正常人，且与胃癌的转移和侵袭风险呈正相关，VEGF在胃癌血管生长的多个途径中起重要作用24。碱性成纤维生长因子受体（basic fibroblast growth factor receptor, bFGFR）是一种受体酪氨酸激酶，与bFGF结合后可激活多条信号转导通路，促进肿瘤血管新生，增加肿瘤组织血液供应，为肿瘤快速、无限制的生长提供营养物质。张君红等25发现bFGFR表达阳性胃癌组织的微血管密度高于阴性者，差异具有统计学意义。另外，bFGFR诱导产生的新生血管结构和功能均异常，血管壁薄弱，缺乏平滑肌，基膜缺如，致使肿瘤细胞容易渗透到有缺陷的微血管内，从而发生转移。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）是由HIF-1和HIF-1亚单位构成的异二聚体26，其中HIF-1对缺氧更具有敏感性27。其在缺氧状态下或常温状态下依赖于内源性活性氧自由基途径活化，激活下游VEGF通路。HIF-1是VEGF最为关键的激活因子，通过调控编码VEGF基因使得VEGF表达增高，达到促血管生长的作用。体积较大的瘤体容易出现组织缺氧缺血，从而激活HIF-1并增加其表达量；同时，HIF-1表达增加会进一步诱导肿瘤血管生成和转移。近期有研究发现，HIF-1在胃癌的表达率较高，直径5cm肿瘤的HIF-1阳性表达率高于直径5cm肿瘤28。血管生成素-2（angiopoietin-2,Ang-2）在肿瘤血管发生发展中起重要作用，通过竞争性结合内皮细胞Tie-2受体，诱导内皮细胞分裂移位，促进血管形成。张忠祥等24报道胃癌患者血清Ang-2含量较正常者明显升高，并与血清VEGF表达量呈正相关性，差异具有统计学意义。早期也有研究观察到VEGF和bFGF存在时，Ang-2促使内皮细胞增殖，缺乏时则诱导细胞凋亡的产生29。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族，能够降解细胞外基质（ECM）和血管壁基底膜，促进新生血管形成，导致全身转移。目前胃癌研究报道证实，MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-14在肿瘤组织中的表达量与肿瘤新生血管密度呈正向调节关系30-33。肿瘤增殖和血管生成过程中MMPs发挥着复杂的机理作用，并伴随大量血管通路信号因子的参与，如MMPs表达增强会引起成纤维生长因子（FGF）、胰岛素样生长因子以及转化生长因子（TGF）的表达量增加，激活更多的信号通路，影响肿瘤细胞的增殖、再生和血管生成34,35。MMPs还可能通过与整合素（integrins）、钙黏蛋白、CD44等黏附分子结合，提高肿瘤的侵袭性，促进血管生长36,37。转化生长因子1（transforming growth factor-1，TGF-1）也是促血管生长因子，可上调VEGF的表达水平，促进肿瘤新生血管的出现38,39。Wang等40观察到胃癌肿瘤组织的TGF-1表达量明显高于胃癌患者的非肿瘤组织或正常人的胃组织TGF-1水平。其他如血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor receptor,PDGFR）、环氧合酶-2（COX-2）、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）等均参与胃癌的新生血管生成过程41,42。以上研究充分显示胃癌仍然是一个依赖于肿瘤新生血管形成的实体肿瘤，阻断胃癌新生血管的生长，是控制胃癌生长、转移的重要方式。通过拮抗肿瘤血管的形成，可能增加化疗的敏感性，逆转化疗耐药，是在目前化疗药物疗效达到平台的另一可能奏效的治疗策略。3、重组人血管内皮抑素（rh-Endostatin，商品名：恩度）用于晚期肿瘤治疗疗效显著恩度是一种由我国学者自主研发的新型可溶性重组人血管内皮抑素，在氨基末端加上了9个氨基酸序列和改变双硫键等，提高了药物的蛋白稳定性和活性，延长了半衰期，并通过大肠杆菌作为表达体系，有效控制了大规模生成的成本。它通过多种作用机制抑制肿瘤生长，包括：1、特异性的作用于血管内皮细胞诱导其凋亡；2、通过调节金属基质蛋白酶的分泌，抑制血管内皮细胞的生物学活性和肿瘤细胞的迁移能力；3、下调血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维生长因子（bFGF）等促血管形成因子的表达，同时上调血小板反应蛋白1和酪氨酸蛋白激酶B3抗体等抗肿瘤形成因子的表达，发挥多靶点抗血管生成作用43；4、使得扭曲异常的肿瘤新生血管趋于正常化，正常化的血管可使血管数量减少，间质压力降低，能够更有效的将氧和化疗药物输送到肿瘤中，从而提高化疗的有效性44。 目前，恩度被批准与化疗联合用于晚期非小细胞肺癌的治疗。Sun等45报道恩度联合NP方案用于晚期非小细胞肺癌能够明显改善患者总的中位TTP、CBR（临床受益反应）和RR（有效率）。2011年韩宝惠报告恩度联合PC方案治疗晚期NSCLC中位OS为17.6个月46。除晚期肺癌外，国内学者尝试将恩度用于其他肿瘤的治疗。秦叔逵等47报告重组人血管内皮抑素与化疗药物联合使用治疗肺癌以外的多种晚期恶性肿瘤具有良好的疗效。除此之外，恩度治疗卵巢癌、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、结肠癌等多种恶性肿瘤带来的疗效均有报道48-53。与其他抗血管形成剂相比，恩度很少导致血压升高、蛋白尿、出血、穿孔等毒副作用，与化疗联合使用不增加化疗的毒性，安全性较好。4、恩度联合紫杉醇治疗难治性胃癌的疗效值得探索 目前胃癌尚缺乏高效的治疗手段，特别对于高度侵袭性的粘液腺癌、印戒细胞癌等，对化疗敏感性差，常伴有血行转移和腹膜转移，治疗方法更是贫乏，且效果不佳。基于恩度治疗晚期肺癌的疗效，我们率先尝试性在临床使用恩度联合常规化疗药物治疗晚期胃癌，显示出了一定的疗效和很好的安全性54。国内其他学者55，56分别采用XELOX、DCF联合恩度治疗晚期胃癌，也得出相同结论。但这些研究均为小样本非随机对照研究，需要更多的基础研究和临床研究数据来证实上述临床的初步发现。考虑到：（1）胃癌的生长、转移依赖于血管形成通路，高度侵袭性胃癌的转移涉及更多的血管生成因子；而恩度为广谱的多靶点抗血管生成药物，能够全面拮抗胃癌细胞的转移途径。（2）紫杉醇为最常使用的胃癌化疗药物，兼具有一定的抗血管生成作用11,研究发现抑制血管形成能逆转紫杉醇耐药57，二者联合应用可能具有协同增效及逆转耐药的作用。（3）恩度毒性较低，与化疗联合不增加化疗的毒性。为此，我们采用高侵袭胃癌MGC803细胞株，开展恩度联合紫杉醇治疗高侵袭性胃癌的体外实验，观察恩度联合紫杉醇对高侵袭性胃癌MGC803细胞株增殖抑制和诱导凋亡作用，并探索其对细胞侵袭能力的影响及其相关作用机制。为后期的体内实验及临床研究提供一定的理论依据。综上所述，目前胃癌治疗尚缺乏高效的治疗手段，特别对于低分化难治性胃癌（粘液腺癌、印戒细胞癌）以及伴有腹膜转移的晚期胃癌患者，治疗方法更是贫乏，且效果不佳。为了提高胃癌的治疗疗效，本实验开展恩度联合紫杉醇治疗高侵袭性胃癌的体内实验，为后期的体内实验及临床研究提供一定的理论依据。主要研究依据如下：（1）恩度作为广谱的多靶点抗血管生成药物，小规模的临床应用已肯定其治疗胃癌的临床疗效，且不易耐药，毒副作用低。紫杉醇作为细胞毒药物，兼具有一定的抗血管生成作用11,二者联合应用可能具有协同增效的作用，治疗难治性胃癌可能具有突破性的临床意义。（2）恩度和紫杉醇均为低毒性的药物，联合应用可以达到低毒高效的特点，特别适用于肿瘤晚期伴有腹膜转移，体质较差的患者。本实验采用高侵袭胃癌MGC803细胞株进行体外实验，观察恩度联合紫杉醇对高侵袭性胃癌MGC803细胞株增殖抑制和诱导凋亡作用，并探索其对细胞侵袭能力的影响及其相关作用机制。重组人血管内皮抑素联合紫杉醇对高侵袭性胃癌细胞的作用及其机制的实验研究实验设计MGC803细胞MMT法检测细胞增殖情况Annexin V-FITC/ PI双标记染色法检测细胞凋亡Transwell小室法检测细胞侵袭能力ELISA法检测细胞上清液VEGF、MMP2表达水平WesternBlot检测细胞中VEGF、MMP2和MMP9的表达水平MTT法检测紫杉醇和恩度单药对MGC803细胞作用24h、48h及72h的IC501.实验材料1.1 细胞株人胃癌MGC803细胞株：解放军第八一医院中心实验室保存并提供。MGC803细胞在含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI-1640培养基中培养。1.2 主要药品和试剂1.2.1 紫杉醇注射液：购自百时美施贵宝投资有限公司，浓度为6mg/ml，生产批号：ZL01249；1.2.2 重组人血管内皮抑制素注射液：购自山东先声麦得津生物制药有限公司，浓度为5mg/ml生产批号：201301007；1.2.3南美胎牛血清（FBS）、RPMI-1640培养基：购自维森特生物技术（中国）有限公司；1.2.4 四甲基偶氮唑蓝（MTT）：美国AMERSCO公司；1.2.5 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒：南京凯基生物科技发展有限公司，批号：KGA105；1.2.6 Matrigel：购自BD公司，货号：356234；1.2.7 FN（fibronectin）：购自Sigma公司，货号：F1141；1.2.8 VEGF、MMP-2 ELISA检测试剂盒：上海恒远生物科技有限公司，货号：HY21128E、HY21092E；1.2.9 VEGF兔抗人多克隆抗体、Matrix Metalloproteinase-2(MMP-2) 兔抗人多克隆抗体、Matrix Metalloproteinase-2(MMP-9) 兔抗人多克隆抗体、-actin内参抗体、HRP标记的羊抗兔二抗：购自上海麦约尔生物技术有限公司；1.2.10 RIPA蛋白裂解液试剂盒：购自碧云天公司；1.2.11 ECL化学发光显示试剂盒、蛋白浓度检测试剂盒、PVDF膜：购自生兴生物技术有限公司，货号为分别为NCI4106；P0010S；88518；1.2.12 四甲基乙二胺（TEMED）：美国AMRESCO公司；1.2.12 10TBS缓冲液配制：将Tris-base 24.2g和NaCl 80g溶解到800ml蒸馏水中，调整PH至7.6，定容到1L；1.2.13 1TBST缓冲液配制：将100ml的10TBS缓冲液用蒸馏水稀释至1000ml,加入0.5ml的Tween-20；1.2.14 10%SDS：将10gSDS（十二烷基硫酸钠）加入100ml的蒸馏水中，加热至60助溶，充分混匀后常温放置；1.2.15 10%过硫酸铵：将0.1g过硫酸铵充分溶解到1ml蒸馏水中；1.2.16 30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺溶于10ml的蒸馏水中，加热至37溶解，加蒸馏水至100ml，用滤头（0.45m孔径）过滤除菌，常温存于棕色瓶中；1.2.17 10running buffer：将30.2g Tric-base、144g甘氨酸和10g SDS充分溶解于1000ml的蒸馏水中；1.2.18 10transfer buffer：将30.2g Tric-base和144g甘氨酸充分溶解于1000ml的蒸馏水中；1.2.19 1.5mol/L Tris-HCL：将Tric-base18.165g溶于50ml蒸馏水中，完全混均后定容至100ml，并用浓HCl调整PH至8.8；1.2.20 1.0mol/L Tris-HCL：将Tric-base12.11g溶于50ml蒸馏水中，完全混均后定容至100ml，并用浓HCl调整PH至6.8。1.3 主要仪器设备1.3.1 细胞培养超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；1.3.2 CO2细胞培养箱：美国SHEL LAB公司；1.3.3低速自动平衡离心机：日本Hitachi公司；1.3.4 超低温冰箱：日本SANYO公司；1.3.5 -4，-20冰箱：德国SIEMENS公司；1.3.6 微量加样器：德国Eppendorf公司；1.3.7 自动酶标读数仪：美国BIO-RAD公司；1.3.8 流式细胞仪：Becton-Dickinson公司；1.3.9 Transwell小室：购自Croning公司，货号：3422；1.3.10 倒置显微镜及照相系统：日本OLYMPUS公司；1.3.11 高速冷冻离心机：德国Beckman公司；1.3.12 雪花制冰机：美国scotsman公司；1.3.13 恒温水浴箱：常州国华电器有限公司；1.3.14 压力蒸汽灭菌锅：上海博迅医疗设备厂；1.3.15 振荡器：上海沪西分析仪器厂；1.3.16 电动摇床：南大普阳科学仪器研究所；1.3.17 电泳仪、电泳槽：美国BIO-RAD公司；1.3.18 凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司。2 实验方法2.1 细胞培养将人胃癌细胞株MGC803接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，置于37、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养。3-4天换液一次，细胞贴壁约70%-80%传代。传代时，先弃去培养液，生理盐水反复冲洗瓶壁3次，滴加0.25%胰蛋白酶消化液覆盖瓶底，显微镜下见细胞变圆，出现间隙时，吸出胰酶，滴加3-4ml培养液中止消化，反复吹打瓶壁细胞，将洗脱的细胞悬液接种于新的培养瓶内。取对数生长期的细胞进行实验。2.2 MTT法测定不同浓度恩度、紫杉醇单药及二者联合对胃癌细胞增殖的影响2.2.1 实验原理MTT试剂是一种黄颜色的染料，其化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT在活细胞被线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。经酸化异丙醇溶解细胞中的甲瓒，生成的甲瓒的量与活细胞数量呈正比，细胞增殖数量越多、越快则颜色越深；细胞数量越少则颜色越浅。因此，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。2.2.2 实验分组 将对数生长期的MGC803细胞分为以下几组开展实验：对照组：加入与实验组等体积的RPMI 1640培养液；紫杉醇组(T)：分别加入不同浓度的紫杉醇注射液，浓度分别为：0.0001g/mL（T0.0001组）、0.0005g/mL（T0.0005组）、0.0025g/mL（T0.0025组）；恩度组(rh-ES)：分别加入不同浓度的恩度注射液,分别为50g/mL（rh-ES50组）、100g/mL（rh-ES100组）、200g/mL（rh-ES200组）；两药联合组：低、中、高三个剂量的紫杉醇和恩度分别两两联合，其中联合50组为0.0001g/mL T+50g/mL rh-ES、联合100组为0.0001g/mL T+100g/mL rh-ES、联合200组为0.0001g/mL T+200g/mL rh-ES。2.2.3 实验步骤 取对数生长期的MGC803细胞，胰酶消化后制成3105个/mL的细胞悬液，每孔100L分别接种于96孔培养板中，置于37、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养24h。加入用培养基稀释到适当浓度的药物100L，使每孔药物终浓度为所需浓度。同时设对照组为不加血清的RPMI 1640培养液。每个浓度设个6复孔。加药细胞分别培养24h、48h、72h后，每孔加入5mg/mL的四氮唑蓝盐（MTT）20L，37孵育4h，吸弃孔内培养基，加入盐酸异丙醇溶液100L，微振荡器振荡10min，用酶标仪在570nm波长下测定各孔吸光度值（A570），各组取6孔平均值。实验重复3次以上。2.2.4 数据处理：计算恩度、紫杉醇单药作用于胃癌MGC803细胞24h、48h、72h的增殖抑制率。细胞增殖抑制率%=1-(加药组平均A570值-空白孔A570值)/(对照组平均A值570-空白孔A570值)100%。根据计算所得细胞抑制率绘制量效曲线。2.3 Annexin-V FITC/PI双标记染色法检测胃癌MGC803细胞凋亡情况2.3.1 实验原理Annexin-V是一种分子量为35.8KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）呈高亲和力特异性结合。在正常细胞中，PS位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡早期，PS可以从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面。暴露于细胞外的PS与经荧光素FITC标记的Annexin-V结合，利用流式细胞仪观察荧光素FITC标记情况可检测到细胞的早期凋亡状况。Propidium Iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，当细胞处于凋亡中晚期时，细胞膜结构不完整，PI可通过细胞膜与细胞核结合呈现红色，利用流式细胞仪检测PI染色细胞可观察到细胞的晚期凋亡情况。2.3.2 实验分组将对数生长期MGC803细胞分为以下实验组：对照组：加入与实验组等体积的RPMI 1640培养液；紫杉醇组(T)：分别加入不同浓度的紫杉醇注射液，浓度分别为：0.0001g/mL（T0.0001组）、0.0005g/mL（T0.0005组）；恩度组(rh-ES)：分别加入不同浓度的恩度注射液,分别为100g/mL（rh-ES100组）、200g/mL（rh-ES200组）；两药联合组：各浓度紫杉醇和恩度两两联合，浓度分别为0.0005g/mL T+200g/mL rh-ES(联合A组)、0.0005g/mL T+100g/mL rh-ES(联合B组)、0.0001g/mL T+200g/mL rh-ES(联合C组)、0.0001g/mL T+100g/mL rh-ES(联合D组)。2.3.3 实验步骤（1）将胃癌MGC803细胞消化、计数、配制成浓度为1105个/mL的细胞悬液，6孔培养板中加入细胞悬液1000L/孔，置于37、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养24h。（2）根据上述分组，用无血清培养基稀释药物至所需浓度，每孔分别加入1000L相应浓度的药物。（3）将已经加药的6孔培养板置于37、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养48h。（4）用0.25%不含EDTA的胰酶消化、收集细胞。（5）加入1mL的PBS溶液，轻轻震荡使细胞悬浮，2000rpm，4离心5min，重复洗涤细胞两次，收集5105个细胞。（6）细胞重悬于500L的Binding Buffer。（7）加入5L的Annexin-V FITC混匀后，加入5LPI混匀。（8）室温避光反应15min后，用流式细胞仪检测（激发波长Ex=488nm;发射波长Em=530nm）细胞的凋亡情况。2.4 Transwell小室测定法检测胃癌MGC803细胞的侵袭能力2.4.1 实验原理将Transwell小室的聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，上室内肿瘤细胞首先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜进入下室。Transwell小室的上室加入肿瘤细胞，下室加入胎牛血清或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞将会向营养成分高的下室迁移，通过计数进入下室的细胞量反映肿瘤细胞的侵袭能力。2.4.2 实验分组取对数生长期MGC803细胞分为以下几组：对照组：加入与实验组等体积的RPMI 1640培养液；紫杉醇组(T)：加入浓度为0.0001g/mL紫杉醇溶液；恩度组(rh-ES)：分别加入不同浓度的恩度注射液,浓度分别为50g/mL(rh-ES50组)、100g/mL(rh-ES100组)、200g/mL(rh-ES200组)；两药联合组：加入紫杉醇和恩度注射液,浓度分别为0.0001g/mL T+50g/mL rh-ES(联合50组)、0.0001g/mL T+100g/mL rh-ES(联合100组)、0.0001g/mL T+200g/mL rh-ES(联合200组)。2.4.3 实验步骤（1）取长满培养瓶底80%左右的对数生长期MGC803细胞，更换为无血清RPMI1640培养液饥饿细胞8h。（2）将Transwell小室放入24孔板中，用Matrigel 50L /孔均匀包被小室底部微孔滤膜的正面，10mg/L的FN 50L均匀包被微孔滤膜的反面，Transwell下室加入600L含30%胎牛血清的RPMI-1640培养液。收集对数生长期的MGC803细胞，用无血清的RPMI-1640培养液调整细胞密度为2105个/ml，每上室依次加入50L细胞悬液。将细胞分组后小室依次加入50L含对应药物浓度培养液，每组3复孔。置37，5%CO2温箱中培养24h。（3）取出小室，吸弃小室内的培养液，用棉签将膜上表面未迁移的细胞小心擦拭。下表面用10%甲醛固定30min，进行苏木素染色20min。（4）在倒置显微镜下（100）观察微孔滤膜外侧面上的细胞，随机计数6个视野内的细胞数，计算平均值。2.5 双抗体夹心ABC-ELISA法检测细胞上清液中VEGF和MMP-2细胞因子水平2.5.1 实验原理双抗体夹心ABC-ELISA法是用特异性抗体包被微孔板，制成固相载体。将受检标本的抗原与固相载体表面抗体结合，再加入生物素化的二抗，形成免疫复合物。用洗涤的方法将固相载体上形成的免疫复合物与其他物质分开。加入辣根过氧化物酶标记的strepavidin与生物素结合，然后加入酶底物OPD后，底物会被酶催化变成黄色产物，加入终止液硫酸，颜色加深。可以根据反应颜色的深浅进行定性或定量分析。该产物的量与标本中受检抗原的量直接相关。用酶标仪在450nm处测吸光度（OD）值，待测抗原的量与OD值呈正比，可通过绘制标准曲线计算出标本中待测抗原的浓度。由于酶的催化频率很高，可以间接的放大免疫反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。2.5.2 实验步骤按照试剂盒说明书操作如下：（1）用碳酸盐缓冲液将抗体稀释至所需浓度，每个反应孔中加入100L，4孵育过夜，次日弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗5min，重复3次。（2）标准品配制：按照对比稀释法稀释标准品，并保证充分混匀。VEGF标准曲线下浓度为：1200、600、300、150、75pg/mL；MMP-2标准曲线下浓度为：8、4、2、1、0.5pg/mL；（3）实验分组同Transwell小室法。包被板上分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，分别加入稀释好的不同浓度的标准品和待测样本50l至相应孔中，注意避免产生气泡，加样时样品加于包被微孔板底部，尽量不触及孔壁。用封板膜封住反应孔，轻轻震荡混匀，37孵箱温育30min。（4）揭掉封板膜，弃去孔内溶液，甩干后每孔加满经蒸馏水稀释的洗涤液，振荡2min后弃去洗涤液，并用吸水纸吸干孔内液体，如此过程重复5次。（5）除空白孔外，每孔加入酶标试剂50l， 37孵育30min，同步骤（4）洗板5次。（6）除空白孔外，每孔加入显色剂A和显色剂B各50l，用封板膜封住反应孔，轻轻震荡摇匀，37避光反应5min。（7）每反应孔加50l的终止液，由蓝色转