细胞生物学实验技术

第三章细胞生物学研究方法,Preparatoryobserve,putforwardtheoretics,Designcontroltests,Collectdata,Explainresults,Deviseconclusion,Refertoknowledge,Howcellsarestudied,你要脚踏实地从事研究并如实报告观察结果；同时也要保持健康长寿。,1983年McClintockB.才获得诺贝尔生理医学奖。,你也有可能获诺贝尔奖,1938年提出“转座子”概念；1944-1950年提出DSAC调控系统（玉米籽粒或叶片色泽调控系统：CDSAC）；1951年提出“跳跃基因”学说。,1965年诺贝尔获奖者为提出与DSAC调控系统非常相似的大肠杆菌乳糖操纵子模型的F.Jacob和J.L.Monod。,1976年在冷泉港召开的“DNA插入因子、质粒和游离基因”专题讨论会上，她才是基因调控“操纵子理论”的先驱。,FluoresceinThelocationofDNAandproteinswithinthesamecell.DNAblueTubulingreenActinredGolgiyellowMitochondriapurple,TechniquesinCellBiology,第一节细胞形态结构的观察方法（细胞水平光镜和电镜）,第二节细胞组分的分析方法（分子水平细胞组分分离与纯化）,第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术（研究工具基因表达与表观遗传）,第四节用于细胞生物学研究的模式生物（细胞是生命的基本单位）,第一节细胞形态结构的观察方法,普通光镜,特殊光镜,形态观察,扫描式电子显微镜,扫描隧道电子显微镜,透射式电子显微镜,冰冻蚀刻技术,紫外光显微镜,暗视野显微镜,相差显微镜,微分干涉差显微镜,荧光显微镜,激光共聚焦显微镜,光学显微镜,电子显微镜,光学显微镜的分辨率与放大倍数：物像是否清楚不在于放大倍数的多少，而是决定于显微镜的分辨率（resolution）大小。,即能够清楚区分两个质点之间的最小距离，称为分辨率。,第一节细胞形态结构的观察方法,显微镜是观察细胞的主要工具,人眼0.2mm,光学显微镜（可见光、紫外光）0.2m。细胞核、线粒体、核仁和染色体的直径大于0.2m的显微结构。,电子显微镜（电子束）0.2nm。病毒核糖体、球形蛋白、小分子、内质网膜、核膜、微管、微丝等小于0.2m的亚显微结构。,第一节细胞形态结构的观察方法,分辨率公式,波长可见光760-380nm紫外光380-180nmx射线13-0.05nm电子束(1万伏)0.0122nm,第一节细胞形态结构的观察方法,NAnsin（/2）n=介质的折射率；=镜口角：标本对物镜镜口的张角，140。,数值孔径（numericaperture）与镜口角（）的关系,第一节细胞形态结构的观察方法,限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长，一般光学显微镜的最大放大倍数为10001500。,小于0.2m的一些细微结构，称为亚显微结构(submicroscopicstructure)或超微结构(ultrastructure)，在光学显微镜下无法看清。,要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。,第一节细胞形态结构的观察方法,结构组成:,（一）普通光学显微镜,照明系统（光源、聚光器）光学放大系统（物镜、目镜）机械装置（载物台）,第一节细胞形态结构的观察方法,光学显微镜的光路图,第一节细胞形态结构的观察方法,切片机(microtome),第一节细胞形态结构的观察方法,细胞厚度一般有2030m，无法看清楚一个完整的一个细胞。标本制备：包括固定、包埋、切片、脱蜡和染色过程,细胞结构呈半透明状，不易看清（原因是什么），往往将标本切片进行染色，提高可辨程度。,第一节细胞形态结构的观察方法,染色的成像原理,1.紫外光显微镜,光源为波长介于180nm-380nm之间，分辨率可提高1倍，可见到普通光镜看不见的胶体颗粒。细胞中的核酸和一些蛋白质可吸收一定波长的紫外线，因而可测定细胞核中的核酸含量。,（二）特殊光学显微镜,因紫外线不易穿透普通玻璃，只能用造价高的石英、萤石、碳酸锂等特殊材料制作透镜，故实用性较差。,第一节细胞形态结构的观察方法,2.暗视野显微镜,光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。能见小于4200nm的微粒子，如核、线粒体清晰可见，分辨率比普通光镜提高50X。,中央遮光板,第一节细胞形态结构的观察方法,视野的背景黑物体的边缘亮,聚光器的设计原理：,第一节细胞形态结构的观察方法,暗视野显微镜光路图,第一节细胞形态结构的观察方法,明暗视场,第一节细胞形态结构的观察方法,3.相差显微镜,1953年获诺贝尔物理奖,1935年，荷兰物理学家F.Zernike研制发明，提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。因活细胞和未染色的细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化（振幅差），人眼无法观察。而相差显微镜通过改变相位差为振幅差，和普通显微镜的区别是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。,第一节细胞形态结构的观察方法,1应用范围,观察未经染色的活细胞、细胞核、线粒体,介壳虫染色体,TheimageofafibroblastinculturebyFourtypesoflightmicroscopy(A)bright-fieldmicroscopy（普通光镜）(B)phase-contrastmicroscopy（相差镜）(C)Nomarskidifferential-interference-contrastmicroscopy（诺马斯基微分干涉差显微镜）(D)dark-fieldmicroscopy（暗视野显微镜）,第一节细胞形态结构的观察方法,观察未经染色的玻片标本,第一节细胞形态结构的观察方法,基本原理,相位：某一时间振动点在振动周期中的位置。,相位差：两束光波在同一时间的相位差距。,（1）相位和相位差,第一节细胞形态结构的观察方法,（2）相干波的相位差与振幅的关系,当两束波的相位差等于零（或等于的整数倍时），其合成波的振幅为两束波振幅之和相长干涉。振幅A3=A1+A2，亮度加强。,当两束相干波1、2相遇时可能发生干涉形成合成波3,当两束波的相位差为/2时，合成波振幅为两波振幅之差相消干涉。振幅A3=A1-A2，亮度减弱。,第一节细胞形态结构的观察方法,（3）相差显微镜的工作原理,光通过密度大的物质时，光的滞留时间长，密度小的滞留时间短。,相差显微镜可将这种光程差或相位差转换成振幅差，从而使标本密度不同的区域转换成亮度明暗的差异。从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。,第一节细胞形态结构的观察方法,光线透过标本后发生衍射，偏离了原来的光路，同时波长被延迟了1/4;如果再增加或减少1/4，则光程差变为0或1/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，增强反差。,第一节细胞形态结构的观察方法,相差显微镜有2个特殊构造,1.环形光阑annulardiaphragm2.相位板annularphaseplate,第一节细胞形态结构的观察方法,上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）：环形区的设计深度（或高度）恰好可使通过此区的光线提前或延后1/4光程差。,使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。,第一节细胞形态结构的观察方法,相差显微镜的光路图解,根据设计：只有未透过标本的直射光可通过相板环形区，而透过标本的偏折光则由相板其它部分通过。两组光线和轴后发生干涉现象。,第一节细胞形态结构的观察方法,S+D,S,D,凸形相板,-1/4,+1/4,两组光波相加，振幅加大，形成亮反差（负反差）标本结构比周围介质更加变亮。,直射光,衍射光,第一节细胞形态结构的观察方法,S-D,S,D,凹形相板,通过样品的光线延后1/4,-1/4,-1/4,两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（正反差）结构比周围介质更加变暗。,第一节细胞形态结构的观察方法,4.微分干涉差（DIC）显微镜,DIC显微镜是Nomarski(1952)在相差显微镜原理的基础上发明的，又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示三维立体结构的投影影像。,第一节细胞形态结构的观察方法,DIC显微镜的应用,1.标本可略厚一点，折射率差别更大。,2.适合于如核、线粒体等立体感特别强的细胞器的显微操作。,3.基因注入、核移植、转基因等的显微操作。,第一节细胞形态结构的观察方法,计算机辅助DIC显微镜,Extendingthelimitsofdetection.Light-microscopeimagesofunstainedmicrotubulesthathavebeenvisualizedbydifferential-interference-contrastmicroscopyfollowedbyelectronicimageprocessing.Theoriginalunprocessedimage.(B)Thefinalresultofanelectronicprocessthatgreatlyenhancescontrastandreducesnoise.,（Electronicimageprocessing）,第一节细胞形态结构的观察方法,观察微管上颗粒的运动情况,ObservinglivingspecimensGreatlyincreasethecontrastofanimagesothatverysmallobjectsbecomevisible,录像增差显微镜技术（Video-enhancecontrastmicroscopy,第一节细胞形态结构的观察方法,BF,DIC,RC,光镜下的7种观察方式,PH,DF,FL,POL,第一节细胞形态结构的观察方法,5.荧光显微镜,利用较短波长的光使标本受到激发产生较长波长的荧光成像而被观察到。观察和分辨标本中某些物质的分布、性质和数量的显微镜。,是目前在光镜水平上对特异蛋白质等生物大分子定性定位研究的最有力工具之一。,第一节细胞形态结构的观察方法,Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroic(beam-splitting)mirror(2).Inthisexamplethefiltersetfordetectionofthefluorescentmoleculefluoresceinisshown.,光学原理,第一节细胞形态结构的观察方法,第一节细胞形态结构的观察方法,自发荧光（物质分子本身）叶绿素+UV红色荧光纤维素+UV黄色荧光间接荧光（物质分子+荧光染料）酸性品红、吖啶橙、甲基绿、刚果红)+UV荧光如：RNA+吖啶橙橙色荧光DNA+吖啶橙绿色荧光,荧光的发生,第一节细胞形态结构的观察方法,荧光染料（Fluorescentdyes）,Thestructuresoffluoresceinisothiocyanate（FITC,异硫氰酸荧光素）andtetramethylrhodamineisothiocyanate（TRITC，四甲基异硫氰酸罗丹明）,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.FITCemitsgreenlight,whereastheTRITCemitsredlight.,第一节细胞形态结构的观察方法,荧光探针:荧光素、荧光抗体,Tubulin呈绿色、Actin红色、Nuclei蓝色,第一节细胞形态结构的观察方法,分裂细胞的免疫荧光图像,不同荧光染料,标记,抗体,抗原(细胞的蛋白质成分),特异性结合,荧光抗体,第一节细胞形态结构的观察方法,第一节细胞形态结构的观察方法,转入GFP基因的烟草单细胞：A为转入GFP基因；B为转入SCaM1-GFP融合基因；C为转SCaM4-GFP融合基因。,细胞核和GFP定位（录像）,荧光标记观察,LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue),第一节细胞形态结构的观察方法,6.倒置显微镜(荧光相差),莱卡倒置显微镜,培养细胞的观察,第一节细胞形态结构的观察方法,与普通显微镜组成同，但物镜（相差）在载物台之下，照明系统在载物台之上。,7.激光扫描共聚焦显微境（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM）,共焦：扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的1.5倍。,第一节细胞形态结构的观察方法,LSCM成像原理：传统光镜使用场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点衍射或散射光的干扰。LSCM利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，在探测针孔处成像，再经光电倍增管逐点或线接收于计算机监视屏幕上形成荧光图像。,第一节细胞形态结构的观察方法,用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。,第一节细胞形态结构的观察方法,ComparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopyThesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stage（原肠期）Drosophilaembryo（果蝇）thathasbeenstainedwithafluorescentprobe（荧光探针）foractinfilaments（肌动蛋白微丝）.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.,第一节细胞形态结构的观察方法,4.冰冻蚀刻技术,2.扫描式电子显微镜（SEM）,3.扫描隧道电子显微镜（STM）,1.透射式电子显微镜（TEM）,二、电子显微镜,电镜问世的必然性,第一节细胞形态结构的观察方法,各种光及电子束的波长,第一节细胞形态结构的观察方法,利用高能量电子束轰击样品表面激发出各种物理信号，再利用不同的信号探测器接受物理信号转换成图象信息。鉴定微区域晶体结构、微细组织、化学成分、化学键和电子分布情况。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。,TEM分辨率达到0.2nm,第一节细胞形态结构的观察方法,由于电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05m（50nm）的超薄切片，并放在铜网上。,第一节细胞形态结构的观察方法,步骤:(1)固定：通常以锇酸和戊二醛固定样品(2)脱水：丙酮或乙醇(3)包埋：环氧树脂(4)切片：超薄切片机，切片厚度2050nm(5)染色：切片采用重金属盐染色，以增大反差,第一节细胞形态结构的观察方法,负染色技术：用重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸铀）对铺展在载网上的样品进行染色。吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。可用于观察细胞内生物大分子，如微丝。,第一节细胞形态结构的观察方法,电镜与光镜的主要区别,第一节细胞形态结构的观察方法,电镜与光镜的成像原理比较：,第一节细胞形态结构的观察方法,1932年Ruska在Siemens设计制造了世界上第一台以电子束为光源的透射电子显微镜,第一节细胞形态结构的观察方法,TEM（transmissionelectronmicroscope）,TEM的基本构造,（1）电子束照明系统（2）电磁透镜成像系统（3）真空系统（4）记录系统,第一节细胞形态结构的观察方法,TEM成像基本原理,与光学显微镜基本一样，所不同的是用电子束作光源，用电磁场作透镜。利用样品对电子的透射和散射形成明暗反差。,第一节细胞形态结构的观察方法,超薄切片技术的应用,1观察细胞内部或表面的超微结构。,第一节细胞形态结构的观察方法,Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalionsThecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.,内质网透射电镜图（伪彩色）,第一节细胞形态结构的观察方法,超薄切片技术的应用,2超薄切片技术与放射自显影、细胞化学、免疫电镜、电镜原位杂交等技术结合，用于不同目的的研究。,第一节细胞形态结构的观察方法,二磷酸腺苷(ADP)酶的定位,Electronmicrographofacellshowingthelocationofaparticularenzyme(nucleotidediphosphatase)intheGolgiapparatusAthinsectionofthecellwasincubatedwithasubstratethatformedanelectron-denseprecipitate(沉淀）uponreactionwiththeenzyme,第一节细胞形态结构的观察方法,Electronmicrographsofaninsulin-secretingcellinwhichtheinsulin（胰岛素）moleculeshavebeenlabeledwithanti-insulinantibodiesboundtotinycolloidalgold（胶体金）spheres.Mostoftheinsulinisstoredinthedensecores（密集核心）ofsecretoryvesicles（分泌泡）;inaddition,somecoresarebeingdegradedinlysosomes（溶酶体）,观察胰岛素分泌细胞,Immunogoldelectronmicroscopy,第一节细胞形态结构的观察方法,扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM，）,工作原理：电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品的表面结构有关，次级电子由探测器收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层金膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,第一节细胞形态结构的观察方法,SEM可用来观察标本的表面结构,Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Forcomparison,thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).,第一节细胞形态结构的观察方法,SEM观察培养细胞的表面结构,Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.,第一节细胞形态结构的观察方法,第一节细胞形态结构的观察方法,3.扫描隧道显微镜,其关键部件是有一个加上一定电压的精密探针，当探针接近物质时，由于隧道效应而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。,Binnig、Rohrer等(1981)发明。,荣获1986年物理学诺贝尔奖！,(scanningtunnelingmicroscope,STM),第一节细胞形态结构的观察方法,STM原理,当原子尺度的针尖在不到1nm的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一低电压（2mV2V），针尖与样品之间产生隧道效应，而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化，即可显示出样品表面原子水平的凹凸形貌。,STM的成像原理,第一节细胞形态结构的观察方法,扫描隧道显微镜的分辨率很高（横向为0.1-0.2nm,纵向可达0.001nm）。,扫描隧道显微镜能直接观察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白质等)的原子布阵，也能观察一些生物结构(如生物膜、细胞壁等)的原子排列。在生物学研究中发挥着重要作用，将把生物学研究推进到纳米科学水平。,其优越之处：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。,STM应用,第一节细胞形态结构的观察方法,STM下金原子的晶格排列图像,第一节细胞形态结构的观察方法,扫描出的纳米级图像,STM拍摄的“血细胞”,第一节细胞形态结构的观察方法,STM特征,（1）具有原子尺度的高分辨率，侧向分辨率0.1-0.2nm，纵向分辨率0.001nm。（2）可以在真空、大气、液体（接近于生理环境的离子强度）等多种条件下工作，这在生物学研究领域尤其重要。（3）可进行非破坏性测量，因为扫描可以不接触样品，没有高能电子束轰击。,第一节细胞形态结构的观察方法,亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。,4.冰冻蚀刻技术,(freeze-etching),第一节细胞形态结构的观察方法,将标本于-100干冰中或-196液氮中，超低温冰冻。然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构蚀刻(etching)。,冰冻蚀刻技术的操作步骤:,第一节细胞形态结构的观察方法,蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜(replica)。,复膜,复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,第一节细胞形态结构的观察方法,细胞冰冻断裂后的电镜图像,第一节细胞形态结构的观察方法,冰冻蚀刻技术应用,形貌富有立体感，样品不需要包埋甚至也不需要固定，因而能更好地保持样品的真实结构。冰冻蚀刻技术主要用于观察膜断裂面的蛋白颗粒和膜面结构。,第一节细胞形态结构的观察方法,第二节细胞组分的分析方法,一、细胞组分分离分析技术二、生化与分子生物学技术,一、细胞组分分离分析技术,（一）离心技术（二）流式细胞术（三）细胞电泳（四）层析技术（五）电泳技术,第二节细胞组分的分析方法,（一）离心技术,离心是分离和分析细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子复合体的基本手段。一般认为，转速为1025Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89K者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。,第二节细胞组分的分析方法,离心机结构与原理示意图,第二节细胞组分的分析方法,被离心的物质所受的离心力不仅与转速有关，而且还同物质到转头中心的距离有关。因此要准确表示离心条件要用离心力，而不单是转速。离心力(g)是由角速度（）和旋转半径(R)的大小决定的，单位为克，计算公式如下:,RCF=1.11810-52R,第二节细胞组分的分析方法,各种颗粒在离心场中的沉降速度不同，这取决颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬液介质的密度和粘度有关。即,式中S为沉降系数(秒)；V为沉降速度；R为沉降颗粒到转头中心的距离(cm)；为角速度（弧度/秒）,当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离心场强度的沉降速度为定值。每单位重力的沉降时间即为沉降系数(Sedimentationcoefficient,S)。,S=V/2R,V=dr/dt(单位时间内旋转半径的改变),FCR=M2r或F=V.D.2r,第二节细胞组分的分析方法,根据分离的对象和目的不同，超离心技术可分为两大类：,用于制备和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品,分析和测定制剂中大分子的种类和性质(浮力密度和分子量等),第二节细胞组分的分析方法,利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程示意图,第二节细胞组分的分析方法,1差速离心（differentialcentrifugation）,基本原理：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞、细胞器、生物大分子。,第二节细胞组分的分析方法,2密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）,基本原理：用一定的介质（氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖）在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞组分按不同的速率沉降，形成不同的沉降带（分层、分离）。,差速离心将细胞器初步分离，密度梯离心进一步分离纯化。,第二节细胞组分的分析方法,速度沉降介质密度较低，变化平缓，离心力小，时间短。主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。等密度沉降介质密度较高，变化陡峭，离心力大，时间长。适用于分离密度不等的细胞器和大分子颗粒，不适于分离细胞。,密度梯度离心的2种类型,第二节细胞组分的分析方法,A等速度沉降，B等密度沉降,第二节细胞组分的分析方法,差速离心,密度梯度离心,CsCl密度梯度离心,蔗糖密度梯度离心,第二节细胞组分的分析方法,（二）流式细胞术,流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。,(fluorescence-associatedcellsorting,FACS),第二节细胞组分的分析方法,FACS工作原理,第二节细胞组分的分析方法,流式细胞术应用,可以对细胞中DNA、RNA、蛋白质等含量进行定量分析；某含量的细胞数量测定。分选细胞、细胞核、染色体、细胞器等。（如分选含X和Y染色体的精子等）,第二节细胞组分的分析方法,（三）细胞电泳,在一定pH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳（cellelectrophoresis）。,第二节细胞组分的分析方法,引起细胞电泳的电位值称为电位。在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的电位。电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊断疾病上有一定价值。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。因此，细胞电泳可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开。,第二节细胞组分的分析方法,（四）、层析技术,用于细胞组分的分离及其纯化,1.凝胶过滤层析,第二节细胞组分的分析方法,2.离子交换柱层析,第二节细胞组分的分析方法,3.亲合层析,第二节细胞组分的分析方法,层析技术纸层析法,separationofsmallmoleculesbypaperchromatographyAfterthesamplehasbeenappliedtooneendofthepaper(theorigin)anddried,asolutioncontainingamixtureoftwoormoresolventsisallowedtoflowslowlythroughthepaperbycapillaryaction.Differentcomponentsinthesamplemoveatdifferentratesinthepaperaccordingtotheirrelativesolubilityinthesolventthatispreferentiallyadsorbedontothefibersofthepaper.,第二节细胞组分的分析方法,层析技术柱层析,Thesampleisappliedtothetopofacylindricalglassorplasticcolumnfilledwithapermeablesolidmatrix,suchascellulose,immersedinsolvent.Thenalargeamountofsolventispumpedslowlythroughthecolumnandiscollectedinseparatetubesasitemergesfromthebottom.Variouscomponentsofthesampletravelatdifferentratesthroughthecolumnandaretherebyfractionatedintodifferenttubes.,Theseparationofmoleculesbycolumnchromatography.,第二节细胞组分的分析方法,Threetypesofmatricesusedforchromatography.Inion-exchangechromatography(A)theinsolublematrixcarriesionicchargesthatretardmoleculesofoppositecharge.MatricescommonlyusedforseparatingproteinsareDEAE-cellulose,whichispositivelycharged,andCM-celluloseandphosphocellulose,whicharenegativelycharged.Ingel-filtrationchromatography(B)thematrixisinertbutporous.Moleculesthataresmallenoughtopenetrateintothematrixaretherebydelayedandtravelmoreslowlythroughthecolumn.Beadsofcross-linkedpolysaccharide(dextranoragarose)areavailablecommerciallyinawiderangeofporesizes,makingthemsuitableforthefractionationofmoleculesofvariousmolecularweights,fromlessthan500tomorethan5x106.Affinitychromatography(C)utilizesaninsolublematrixthatiscovalentlylinkedtoaspecificligand,suchasanantibodymoleculeoranenzymesubstrate,thatwillbindaspecificprotein.,第二节细胞组分的分析方法,（五）电泳技术,SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS-PAGE),第二节细胞组分的分析方法,Two-dimensionalpolyacrylamide-gelelectrophoresis.AlltheproteinsinanE.colibacterialcellareseparatedinthisgel,inwhicheachspotcorrespondstoadifferentpolypeptidechain.Notethatdifferentproteinsarepresentinverydifferentamounts.Thebacteriawerefedwithamixtureofradioisotope-labeledaminoacidsandtheresultwasdetectedbyauto-radiography.,第二节细胞组分的分析方法,二、生化与分子生物学技术,（一）细胞化学技术（二）免疫细胞化学（三）放射自显影术（四）分子杂交技术（五）PCR类技术,第二节细胞组分的分析方法,（一）细胞化学技术,基本原理：组织化学或细胞化学染色（histochemicalorcytochemicalstaining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。,第二节细胞组分的分析方法,组织化学和细胞化学染色方法(histochemicalandcytochemicalstainingmethod)依据化学反应原理，对无色透明细胞的某些成分进行定性和定位研究。细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成份发生反应而着色的原理，从而得以对某种成份进行研究和分析。,利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。,第二节细胞组分的分析方法,最典型的组织化学显示法是Feulgen反应显示法(Feulgenreaction)。此法由Feulgen和Rossenbeck(1924)发明，对DNA的反应具有高度专一性。,其原理是:标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红与醛基反应，形成含有醌基的化合物，醌基为发色团，呈现出紫红色。,第二节细胞组分的分析方法,第二节细胞组分的分析方法,1固定方法,目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来。（1）物理固定：如冷冻干燥或直接冷冻切片。（2）化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构和其中的某些化学物质加以固定保存。,第二节细胞组分的分析方法,2显示方法,1）金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2）偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。3）Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示多糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应，红色）。,第二节细胞组分的分析方法,4）联苯胺反应：过氧化物酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。5）Formazane反应：显示脱氢酶。6）“Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。7）脂溶染色法：借苏丹III染料溶于脂类而使脂类显红色。8）茚三酮反应：显示蛋白质。,第二节细胞组分的分析方法,3显示方法举例,核酸反应Feulgen反应：DNA+Shiff试剂紫红色Brachet反应：派洛宁染液（甲基绿+DNA蓝绿色）（吡咯红+RNA红色）,第二节细胞组分的分析方法,蛋白质的Millon反应：氮-汞试剂+蛋白质（酪氨酸）红色,第二节细胞组分的分析方法,酶反应,碱性磷酸酶的Gomori反应：,第二节细胞组分的分析方法,多糖反应,PAS反应：可用于多糖、粘多糖、粘蛋白的检测。多糖+过碘酸+无色品红紫红色,第二节细胞组分的分析方法,脂类反应,四氧化锇+脂肪酸（不饱和）黑色苏丹可使脂滴着红色，苏丹黑可使磷脂和胆固醇着黑色。,第二节细胞组分的分析方法,免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原结合，对抗原进行专一定位测定的技术。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。,（二）、免疫细胞化学(immunocytochemistry),第二节细胞组分的分析方法,常用的标记物有荧光素和酶：,标记荧光素的称为免疫荧光法(immunofluorescenttechnique)，常用的萤光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。标记酶的称为酶标免疫法(enzyme-labelledantibodymethod)，常用的酶有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)等，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物或有色物，从而显示出抗原的存在部位。,第二节细胞组分的分析方法,抗体与抗原的结合方法可分为以下两种：,直接法,间接法,将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位,第二节细胞组分的分析方法,间接免疫细胞化学法的原理示意图,第一抗体（一抗）,第二抗体（二抗）,第二节细胞组分的分析方法,微管呈绿色微丝红色核蓝色,第二节细胞组分的分析方法,用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态,第二节细胞组分的分析方法,Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay（ELISA),此颜色深浅可用酶标仪精确地测定出来,酶联免疫吸附试验,酶与底物反应产生有色产物，颜色深浅代表了反应的强弱,卤虫孵化腺细胞的ELISA染色照片(樊廷俊等,2003),第二节细胞组分的分析方法,（三）放射自显影术(autoradiography),用于研究生物大分子（DNA、RNA、蛋白质、多糖等）在机体、组织和细胞中的分布、定位、合成动态、作用机理等。,第二节细胞组分的分析方法,放射性同位素发射出的各种射线能使照相乳胶中的溴化银晶体还原(感光)。利用放射性物质使照相乳胶膜产生该物质自身影像的技术，称为放射自显影术。放射自显影的切片用染料染色后，便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。,第二节细胞组分的分析方法,由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用14C和3H标记(14C和3H均为弱放射性同位素，半衰期长:14C为5730年;3H为12.26年)。,一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷来显示DNA，用3H-尿嘧啶核苷显示RNA。在研究蛋白质和粘多糖时，则分别选用3H-氨基酸和3H-甘露糖、3H-岩藻糖等。,第二节细胞组分的分析方法,基本步骤、原理,标记的前体小分子饲喂生物体或细胞（核苷酸、氨基酸、脂肪酸等）制片涂卤化银乳胶放射自显影（曝光、显影、定影）观察（光镜、电镜）：确定标记物的位置和数量,第二节细胞组分的分析方法,InsituhybridizationforRNAlocalizationintissues.AutoradiographofasectionofaveryyoungDrosophilaembryothathasbeensubjectedtoinsituhybridizationusingaradioactiveDNAprobecomplementarytoageneinvolvedinsegmentdevelopment.TheprobehashybridizedtoRNAintheembryo,andthepatternofautoradiographicsilvergrainsrevealsthattheRNAmadebythegene(ftz)islocalizedinalternatingstripesacrosstheembryothatarethreeorfourcellswide.Atthisstageofdevelopment(cellularblastoderm),theembryocontainsabout6000cells.,第二节细胞组分的分析方法,Theresultsofapulse-chaseexperimentinwhichpancreatic（胰腺）betacellswerefed3H-leucine（亮氨酸）for5minutesfollowedbyexcessunlabeledleucine(thechase).Theaminoacidislargelyincorporatedintoinsulin（胰岛素）,whichisdestinedforsecretion.Aftera10-minutechasethelabeledproteinhasmovedfromtheroughERtotheGolgistacks(A),whereitspositionisrevealedbytheblacksilvergrainsinthephotographicemulsion.Afterafurther45-minutechasethelabeledproteinisfoundinelectron-densesecretorygranules(B).,第二节细胞组分的分析方法,常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷显示DNA的放射自显影图像,第二节细胞组分的分析方法,放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行电镜自显影（electron-microscopicautoradiography）。,电镜自显影照片,第二节细胞组分的分析方法,（四）分子杂交技术,分子杂交技术（molecularhybridization）是在研究DNA分子复性变化基础上发展起来的一种技术。,第二节细胞组分的分析方法,基本原理：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。应用：（1）测定核苷酸序列间是否具有互补关系。（2）检测特异核酸（DNA、RNA）序列在染色体上或细胞中的位置。,第二节细胞组分的分析方法,核酸杂交原理示意图,第二节细胞组分的分析方法,1原位杂交（insituhybridization）,检测特异核酸序列在染色体上或细胞中的位置。放射性DNA探针：通过放射自显影来显示位置。免疫探针：将核苷酸探针的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,第二节细胞组分的分析方法,荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH):,FISH技术的原理图解,第二节细胞组分的分析方法,DNAchip技术,第二节细胞组分的分析方法,第二节细胞组分的分析方法,2Southe