植物染色体原位杂交

植物染色体原位杂交技术,原位杂交In situ hybridization，简称ISH，也称作杂交组织化学或细胞学的杂交，是一种能够从形态学上证明特异性的DNA或RNA序列存在于个别细胞、组织部分，单细胞或染色体中的技术，是分子生物学和组织化学、细胞学结合的产物。原位杂交技术是从Southern和Northern杂交技术衍生而来，包括染色体原位杂交和RNA原位杂交，其基本原理是：含有互补顺序的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内的DNA或RNA形成稳定的杂交体。,染色体原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补配对的原则(AT，GC)，将有放射性和非放射性标记的探针与染色体上经过变性后的单链DNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，再经过一定的检测手段将待测核酸在染色体上的位置显示出来。,一、荧光原位杂交二、基因组原位杂交 三、原位PCR四、引物原位杂交技术五、原位杂交结合显带标记技术六、原位杂交结合免疫组织化学的双标记技术七、电镜原位杂交技术八、整体荧光原位杂交技术九、DNA纤维荧光原位杂交 fiber-FISH,原位杂交技术主要方法,一、荧光原位杂交,(Fluorescence in situ Hybridization) 是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平的分析。,二、基因组原位杂交,(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交是在分子水平上检测外源染色质的一种有效方法,其探针是总基因组DNA.该技术广泛应用于植物进化和亲缘关系的鉴定上。,三、原位PCR,原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。,四、引物原位杂交技术,是通过退火一个寡核苷酸DNA 引物到制备在载玻片上的染色体的变性 DNA 上 ,用渗入 的标记核苷酸在原位进行酶促延长并进行检测的染色体标记技术,染色体原位杂交简单流程图,探针 靶子1.分离DNA 1. 染色体的制片准备2.标记 2. 杂交前处理3.变性 3.变性 4. 杂交 5.杂交后处理（解离非特异性结合的双链，除去未杂交的探针） 6.杂交体的检测（杂交DNA呈现颜色A,未杂交的呈现颜色B）,单链DNA,原位杂交技术流程,一、染色体制片的准备1制片在60烘箱中干燥过夜2用100ulml的RNaseA(2SSC配制)，37小时，2SSC漂去盖片，2SSC35分钟洗涤，70-95一100乙醇脱水，每级3分钟。3用0.01Pepsin(10mMHCI配制)，37，20-40分钟，1PBS25分钟。41甲醛(50MmMgCl2，1XPBS配制)于室温下固定5分钟，2SSC35分钟。,二、杂交混合液的准备 20ul杂交混合液： 10ul去离子甲酰胺 4ul硫酸葡聚糖 2u120SSC 1ul探针，2ul封阻DNA在涡流混合器上混匀 在PCR仪上97变性10分钟，迅速转入冰水中 至少10分钟,二、探针及杂交液的准备1、基因组DNA改良CTAB法2、rDNA（45S和5S）含有目的基因的质粒DNA,1、DNA 8 l，100 煮沸，立即冰浴10min左右，室温，加标记物2 l，充分混匀，37 16h以上2、杂交缓冲液配制3、杂交液配制杂交缓冲液+探针（2 g/ l ）+封阻DNA，变性再复性，室温离心收集溶液,rDNA,在高等真核生物中，核糖体是合成蛋白质的场所。一个完整的核糖体由60S、40S大小亚基组成，构成核糖体亚基的主要成分是核糖体-RNA(rRNA)与蛋白质的复合物。 其中rRNA有4种类型，即18SrRNA、5.8S rRNA、28S rRNA和5S rRNA。编码这几种rRNA的基因有2种，一种为45S rDNA，另一种为5S rDNA。,45S rDNA是高度保守串联重复序列有几千拷贝数，特异定位于染色体的核仁组织区(Nucleolar Organizing Region,NOR)，细胞形态学上显示为次缢痕，其远端是随体(satellite)。 其编码区的保守性和非编码区的多态性是研究动植物系统发育与进化的一个有用标记，而且由于该基因为高度重复序列，在近缘物种中发生着位于染色体上的位点以及同一位点基因拷贝数多少的变化，因而通过rDNA-FISH技术对其在染色体上分布的位置、位点以及拷贝数多少进行比较研究，可以确定近缘物种的亲缘进化关系及起源。 而5S rDNA虽然也是串联重复序列，但其并不位于核仁组织区上。,三、杂交5取10-20ul杂交液滴于制片上，加塑膜盖片，包装于80共变性10分钟6转入37水浴中杂交过夜,四、洗脱和信号检测 7杂交制片用2SSC漂洗去盖片，0.1SDS(2SSC配制)3735分钟，0.1SDS(02SSC配制) 3735分钟，2SSC室温下冲洗2次，甩干制片。 8加50ul片5BSA(4SSCTeween20配制)，加盖片，37封阻30分钟。 9甩干封阻液(制片不能见干)，加30ul片AlUi-DIG-FITC或Anti-DIG-Rhodamine抗体20ugml溶于含5BSA的1XPBS中)，加盖片，37温育1小时。10在1XPBSTeween20(02)中，373X5分钟，用PI(2ugml,1PBS配制)30ul/片衬染7分钟或用DAPI(2ugm1)衬染3分钟，1PBS33分钟洗去衬染剂，甩干，用抗荧光衰减剂(Vectashied)封片。,植物染色体原位杂交过程中部分问题的探讨 一、原位杂交的部分影响因素 (1)不同标记方法和标记时间对标记效果的影响 (2) 变性因素对原位杂交的影响 (3) 洗脱强度对原位杂交结果的影响,二、 原位杂交过程中常见问题的分析及解决办法 染色体丢失无杂交信号 杂交信号弱 杂交信号强弱不均杂交信号成块状 背景（噪音）重杂交信号和复染剂耀眼闪亮,甘薯GISH,应 用,ISH在植物进化生物学研究中的应用,重复序列（45S、5SrDNA）在近缘类群定位的比较研究,GISH的应用,rDNA应用,45srDNA(黑麦),黑麦间期核,玉米 A为杂交前核型； B为同一核型杂交后结果,玉米间期核 A为杂交前间期核；B为杂交后结果,豆角 A为杂交前核型； B为同一核型杂交后结果,豆角间期核 A为杂交前间期核；B为杂交后结果,水稻 A为杂交前核型； B为同一核型杂交后结果,水稻间期核 A为杂交前间期核；B为杂交后结果,白菜 A为杂交前核型； B为同一核型杂交后结果,芋头间期核 A为杂交前间期核；B为杂交后结果,荔枝,菜花,西葫芦,黄瓜（津春四号）,黄瓜（津优一号）,黄瓜（津优一号）间期核,黄瓜（津优一号）间期核,GISH的应用,染色体配对分析及基因组类型的确立GISH与异源多倍体的起源以及基因组间关系的研究异缘姐妹种（sibling species）的基因组分化的研究,片断扩增应用,黑麦A、B染色体着丝粒区DNA同源性的荧光原位杂交分析,黑麦A、B染色体端粒区同源性的荧光原位杂交分析,B染色体微切割片段在玉米中期和间期细胞(2n=20+4B)中的原位杂交定位,小偃麦代换易位系的GISH核型。St组DNA作探针、小麦总DNA作封阻,表明其染色体组成为2n=42=38w+1E+1E/W(端部)+2W/St(端部),八倍体小偃麦TAI7045的GISH分析。用St基因组DNA作探针、小麦总DNA作封阻表明其染色体组成为2n = 56 = 42 wheat + 6 St + 2 St-sat + 4 Es + 2 Es/St,Fiber-FISH,在FISH分辨率的决定因素中，最重要的是所用的靶DNA分子在其载体上的浓缩度，也就是DNA分子的三维空间包裹程度。由Heng、Wiegant等首创的DNA纤维上的FISH，将分辨水平提高到与常规分子生物学技术Southern Blot分析相当的水平。1996年Fransz等人将这一技术引入植物拟南芥和番茄的小重复序列和cosmid连接群研究，之后由钟筱波等人在水稻、玉米、小麦和油菜等多种植物中成功应用。,1.细胞核悬浮液的制备(1 )取2克幼叶，立即放于液氮中冷冻。在液氮中研磨叶片至粉末。将粉末转入一个 50ml的烧杯，置于冰上。(2 )加 20ml冰冷的细胞核提取缓冲液 (10mM TrisHCl pH9.5， 10mM EDTA，100mM KCl，0.5M蔗糖，4.0mM亚精胺，1.0mM精胺，0.1%巯基乙醇 )，轻微搅拌 5min。将细胞匀浆液分别通过孔径为 170、125、50和20的尼龙膜过滤。所有操作需在冰上完成。 (3)向滤液中加 1ml含10%(v/v)Triton-X100的细胞核提取缓冲液，以便除去叶绿体和线粒体。 4下离心2000g，10min。除去上清液，将沉淀物悬浮于200l的细胞核提取缓冲液中。 (4)取1l细胞核悬浮液，用PI染色，在荧光显微镜下检查细胞核的浓度。,2.DNA纤丝的制备(1)取1l细胞核悬浮液，在无尘载片的一端，往返划线涂抹成 1cm2cm的长方形。空气干燥几分钟。在涂好的细胞核上加10l STE细胞核溶解缓冲液 (0.5%SDS，5mM EDTA，10mM Tris，pH7.0 )，室温培养4min。 (2 )将载片涂有细胞核的一端提起，与桌面成 45度角，让缓冲液由重力作用向下流动，游离的分子便会形成平行的DNA纤维。空气干燥后，在卡诺液中固定DNA纤维2min，60烘干30