实用流式细胞技术及其样品处理

实用流式细胞技术及其样品处理,FACSAria (FACSDiva),流式细胞术基本原理在不同领域的应用样品及其前处理,一、流式细胞术基本原理,最大特点：单细胞水平的分析,Detector,单细胞液流柱的形成,利用流式细胞术可以获得哪些信息,细胞的相对计数、绝对计数细胞成分的相对定量、绝对定量单参数或多参数细胞表面、细胞内成分可溶性成分流式分子表型,流式细胞术可以产生哪些信号,细胞的物理参数： 散射光,细胞的理化参数： 荧光,散射光信号,前向角散射（FSC）：与球形细胞直径的平方密切相关。侧向角散射（SSC） ：对细胞膜、细胞质的折射率敏感。对细胞质内较大的颗粒也有反映。用来获取有关细胞内部精细结构和颗粒性质的有关信息。,Laser,FSC,SSC,Monocyte,Lymphocyte,Granulocyte,FSC,SSC,荧光信号,单标样品,Laser,42% positiveAntigen A,58% negativeAntigen A,FL2,FSC,双标样品,Laser,Log fluorescence (green),Log fluorescence (red),A+(%),B+(%),A+ B+(%),neg.(%),FSC,FL1,FL2,Histogram,Dot Plot,Contour Plot,Pseudo 3-dimension Plot,3-dimension Plot,Unimodal or bimodal,道数（channel）荧光强度坐标不等距,“Particle” can be used as a more general term for any of the objects flowing through a flow cytometer. “Event” is anything that has been interpreted by the instrument, to be a single particle , correctly or incorrectly. Each measurement from each detector is referred to as a “parameter”. Data are stored in so-called flow cytometry standard (FCS) format. Data stored on one cytometer may not be analyzable on software from another cytometer.,细胞分选,分选纯度分选产率,厂家、型号、激光器、滤光片、软件,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,Long passShort passBand pass,滤光片,二、在不同领域的应用,细胞周期分析细胞功能分析细胞凋亡分析免疫学领域其他领域,（一）细胞周期分析,Cellular DNA content,必须用RNase去除RNA,DNA合成-BrdU Incorporation,增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）: 参与DNA复制和核酸的切补修复（excision repair ）的一种蛋白增殖相关抗原（proliferation related antigen）：Ki-67，Ki-S1细胞周期蛋白：Cyclin D1, E, A, B1,（二）细胞功能分析,细胞活性分析细胞膜电位线粒体膜电位、膜蛋白抗原7A6细胞内Ca2+胞浆内pH活性氧（ROS）,1、细胞活性分析,根据对细胞膜的渗透性不同来区分活/死/凋亡细胞： PI，EB，7-AAD and Hoechst 33342,2、细胞膜电位,由于细胞膜上各种泵的作用，如钠钾泵、钙泵等，使细胞膜内外维持着不同离子的浓度梯度，造成细胞膜电位,3、线粒体膜电位（MMP）,线粒体在呼吸氧化过程中，将所产生的能量以电化学位能储存于线粒体内膜。JC-1可进入细胞内，特异地与线粒体内膜结合，其聚集程度随MMP升高而增加。,4、线粒体膜蛋白抗原7A6 （38kDa ）,凋亡早期的反应，早于形态学、光学特征变化及台盼蓝染色,5、细胞内Ca2+,浓度上升，与两种情况有关。一是与细胞活化，二是细胞膜完整性遭到破坏，可作为细胞凋亡或坏死的标志。,6、胞浆内pH,活细胞内pH变化范围较小。某些生物学过程，如细胞分裂及对细胞信号的应答，会出现pHi的变化。增殖细胞比静止期细胞偏碱性。,7、活性氧（ROS）参与细胞生长、发育、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。,DCFH-DA本身没有荧光，在细胞内转化成DCFH。在ROS作用下，氧化为绿色荧光物质DCF。其荧光强度与细胞内ROS水平成正比。,（三）细胞凋亡分析,1、散射光信号的变化,2. DNA含量,3、磷脂酰丝氨酸外翻（Phospholipid redistribution）,4、Caspases-3的激活,凋亡晚期，核酸内切酶活化，双链DNA会出现许多不对称断裂点，产生一系列的3末端。TdT酶能够催化外源性荧光素-dUTP连接到DNA的3末端。尽管坏死细胞的细胞核DNA 也在降解，末端也增多。但这种随机的降解所产生的末端较难与荧光素-dUTP结合。因而，坏死的细胞进行TUNEL反应观察不到荧光。,5. TUNEL,6. p53,53 kDa的核内磷蛋白，在细胞周期中，控制着细胞在DNA损伤无法修复时启动细胞的“自杀”过程。P53突变或缺失是多种肿瘤发生的重要原因。,（四）在免疫学领域的应用,NK细胞中有CD8+细胞;少量的单核细胞也能表达CD4;结合淋巴细胞绝对数来看待某一亚群百分比的改变。,1、淋巴细胞亚群分析,评价机体的免疫状态：自身免疫、免疫缺陷等,Nave / Memory T lymphocyte,刚从胸腺移出到外周循环的Naive细胞，首次遇到抗原时，增殖反应强，产生细胞因子能力弱。当Memory细胞遇到同类抗原时，产生大量的细胞因子，而不是增殖反应。Naive T细胞高表达CD45RAhi、CD62Lhi。Memory T细胞表达CD45RO，一般不表达CD45RA从Naive向Memory细胞转化过程中，CD11a表达增加、CD62L（L-selectin）表达丢失。,Th1/Th2 lymphocyte,T细胞根据其分泌的细胞因子分为两型。Th1类细胞分泌IL-2 , IFN-和TNF-，参与细胞免疫，对抗胞内病原体，如病毒；Th2类细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10与IL-13, 参与体液免疫，对抗胞外感染，如寄生虫。,Mouse,chicken （42d ）,chicken （42d ）,2、细胞表面活化抗原的表达,3、细胞因子分析,CBA （Cytometric Beads Assay）分析液体样本中可溶性成分,用一系列荧光强度不同的微球同时分析样本中多种可溶性成分。每种微球大小一致，分别包被有适合于特定分析的特异性抗体。所有分析只需一组标准曲线，检测的线性范围宽（0-5000 pg/ml）,capture Ab,Fluroescent detection Ab,Human Th1/Th2 Cytokine CBA,细胞膜表面的细胞因子分析,将细胞表达的细胞因子阻断在细胞内,CESEstaining cell protein,4、细胞分裂,PKHlipophilic(亲脂性)dye that inserts into the lipid bilayer of the outer membrane.,通过分析，可以计算分化前体频率（precursor frequency）,评价细胞杀伤过程的生物学变化：如效应细胞的凋亡，CTL介导的裂解功能的抑制。,5、CTL功能分析,Fluorogenic Caspase Substrates 检测CTL介导的靶细胞凋亡,In the uncleaved substrates, fluorescence is quenched owing to the formation of intramolecular excitonic dimers.,On cleavage of the peptides by specific caspases, the fluorophorefluorophore interaction is abolished, leading to an increase in fluoresence.,只要合成各种特异性抗原，即可定量体内抗原特异性CTL。,6、抗原特异性T淋巴细胞的分析,其他领域的应用,具有细胞壁的细胞及其细胞壁的主要成分：植物细胞（纤维素）、细菌（肽聚糖）、真菌（几丁质）细菌的大小、质量、核苷酸和蛋白含量等大约是哺乳动物细胞的1/1000 。信号强度低，限制了检测的精确度。细菌吸收和排除染料、药物等受细胞壁结构和孔、泵的影响。,G+：一般不需要额外的处理，便可以吸收大量的试剂。也有例外，如：Walberg等发现，吸入不同的核苷酸染料，也有不同的变化。G-：细胞膜排斥多数亲脂性或疏水分子，如cyanine染料。EDTA等破膜后，可使亲脂性化合物穿透细胞膜，但是，破膜后的特性与自然状态不同。,X4550，X4550(pVAX1-trc-DsRed)，X4550(p3334-DsRed),X6212(p3334-DsRed)，Xa(pVAX1-trc-DsRed),DsRed在不同重组菌中的表达,体外细菌感染效率,病毒感染细胞的检测,流式分子表型（Molecularphenotyping）,FCM-PCR-FISH：细胞中HIV特异性DNA或RNA,如：测定端粒长度,三、样品及其前处理,颗粒：细胞单细胞悬液，避免任何细胞沉积荧光标记仪器的限制：激光器、滤光片-荧光素实验的限制：荧光素组合,总的要求,1、细胞大小,所有的细胞均需要经过过滤：200（75m）-300（45m ）- 400（37m）目,2、细胞物理参数的变化,不同的处理和固定方法也可能造成FSC信号的改变。另外，非球形细胞（禽类红细胞）由于其在液流中空间取向不同，也可能导致对同种细胞的FSC信号完全不同。在可能的情况下，尽量用荧光参数来设门。,3、设门,散射光设门：注意细胞形态的变化,荧光设门：要明显区分阴、阳性细胞,4、荧光补偿,需要用单标样品来调节荧光补偿,5、红细胞的影响,溶血：不影响表面抗原的标记，常用标记后溶血,6、洗涤效果,7、标记效果,胞内抗原（IC：同型对照）,表面抗原（标记荧光和自发荧光）,改变抗体的量是改变浓度而不是体积,less than or equal to 0.5g per million cells in a 100vl total staining volume,避光标记同一实验尽量用同厂家、同批次高质量抗体。按照说明，标记试剂一般不能冻存慎用未经FCM鉴定的抗体首选直标，间标有时效果不好,8、实验对照的设计,空白对照阴性对照：常用同型对照 单色分析：同型对照 多色分析：同型对照、单阳性对照 同型对照：与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白，用于检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。阳性对照：检测阴性时Fc受体的阻断：与抗体匹配的动物的血清或IgG。,9、细胞数量,统计学意义计数：106数量级/0.1-0.5ml非常规检测的样品，调节参数需要消耗一些细胞需要分析的细胞至少要大于500个。DNA分析的样品要大于10000个。,荧光强度与结合位点数量成正比（可用百分数和荧光强度表示）,10、单个细胞成分的定量,DCFH染色检测活性氧的产生（多用荧光强度表示）,11、仪器每次开机的状态都会有一些差异，每次处理的样品也会有所不同，仅有细微差别的实验要在同一次实验过程中完成。,CMF-DA标记检测细胞内酶的活性,12、检测速度,通过改变液流的直径来改变检测速度，液流流速不变。,默认为一个细胞荧光强度升高对于细微差别的比较，结果影响较大DNA样品可用双联体辨别模式（DDM）区分,13、样品中的细胞聚集和碎片要尽量少,Time,Voltage,Time,Voltage,根据细胞通过激光照射点的时间，将光信号成比例的转变成电信号,14、细胞的活性,抗凝剂：肝素 避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程。PI排除死细胞,15、弱表达抗原常选用PE标记,CD8: PerCP APC FITC ECD PC5 PE,16、胞内染色,胞膜和胞内同时表达的抗原: 分别作表面和胞浆内染色。在检测胞浆内抗原时，表面表达必须被控制或视为阴性。固定破膜不能影响抗原属性或抗原抗体结合率。先固定后染色可能会使表面抗原丢失或改变。固定：蛋白的交联和变性。破膜：细胞膜穿孔。1皂甙同时测定表面、胞内Ag和DNA含量：膜胞内DNA。膜抗体荧光素不被破膜剂损坏，对胞内抗体，要保证荧光素分子足够小，能进入胞内。,17、DNA分析,RNA酶处