植物学RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展

,RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展,Interdaction,RNA干涉(RNAinterference,简称RNAi)是指一些小的双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术。可以快速分析靶基因的功能，近年来发展迅速,已成为功能基因组研究和反向遗传学研究的有力工具。RNAi技术被Science杂志评为2002年度的十大科技突破。,RNAi技术概述,RNAi引起基因沉默的途径,植物RNAi表达载体的构建,RNAi技术在植物上的应用,RNAi存在问题与展望,Text1,Text2,Text3,Text4,Text5,Contents,RNAi技术概述,1.1RNAi的发现,1.2RNAi的分子机制,1.3RNAi作用的特点,1.1RNAi的发现,1995年,康乃尔大学的Guo和Kempheus利用反义RNA(antisenseRNA)技术特异性地阻断线虫(C.elegans)中的par-1基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA(senseRNA)相反的结果，但结果却令他们费解：二者同样阻断了par-1基因的表达途径。1998年,Fire和Mello等首次将正义链和反义链的混合物注入秀丽新小杆线虫,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默(genesilencing)。他们将这种现象称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。,1.2RNAi的分子机制,外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,产生一些dsRNA。胞质中的核酸内切酶Dicer将这些dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的短双链RNA(大约2125bp),即siRNA。siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,然后反义siRNA再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,被切割后的断裂mRNA随即降解。,RNAi信号的放大,siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在依赖RNA的RNA聚合酶(RNdependentRNApolymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。,这是一种类似于RNA聚合酶的链式反应，该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RdRP作用下扩增靶mRNA，产生新的二级siRNAs(单链的具有明显极性的反义RNA)。在Dicer酶的作用下，这些二级siRNAs又能反作用于靶mRNA，使其降解，产生更多的siRNAs。,1.3RNAi作用的特点,高效性研究发现RNAi过程中不同浓度的dsRNA产生的效果一样。Miki等研究水稻OsRac基因家族的功能时,通过构建单一基因片段的植物表达载体,成功地抑制了OsRac基因家族的多个基因。说明RNAi可实现在一个个体或一个细胞内同时沉默多个基因。高度特异性由dsRNA诱导的RNAi只引起与dsRNA同源的mRNA降解,不影响其它基因的表达,具有很高的特异性。siRNA具有特征性的结构:5末端为磷酸基,3末端为羟基,并且有2个突出的单链核苷酸。这种结构对RNAi是十分必要的。ATP依赖性研究发现,如果除去或降低内源性ATP含量,dsRNA对靶基因的抑制作用明显降低或消失,加入外源性ATP后,抑制作用仍未加强。说明RNAi是一个对ATP依赖的过程,且外源性ATP对此无促进作用。可传播性在植物中,RNAi信号可以通过胞间连丝或维管组织在细胞间传递;而在动物中,RNAi信号的扩散需要特殊蛋白参与,在膜上形成跨膜通道而传播到整个机体。可遗传性RNAi效应可以稳定的遗传给子代,在子代的表现型呈孟德尔遗传方式。,RNAi技术概述,RNAi引起基因沉默的途径,植物RNAi表达载体的构建,RNAi技术在植物上的应用,RNAi存在问题与展望,Text1,Text2,Text3,Text4,Text5,Contents,转录后基因沉默（PTGS）,转录水平基因沉默（TGS）,翻译水平上基因沉默（miRNA）,RNAi引起基因沉默的途径,转录后基因沉默（PTGS）转录后基因沉默是最普遍的一种沉默机制。PTGS通过降解mRNA来抑制基因的表达。包括几种现象:一种现象是植物中的共抑制(co-suppress)现象,即引起外源基因和靶基因或内源基因同时发生沉默,首次在矮牵牛中发现此现象。此外病毒侵染植物引起基因沉默也属于共抑制现象。另一种是真菌发生静息现象(quelling)。转录水平基因沉默（TGS）它是由siRNA指导染色体发生变化(包括DNA和组蛋白甲基化)是指启动子序列发生甲基化或局部染色体发生变化,影响转录因子的结合,使基因不能正常转录,下调基因表达。,翻译水平上基因沉默这个过程主要是由内源性miRNA介导的一种基因沉默。miRNA的前体(pre-miRNA)是70nt的茎环RNA或双链RNA,它们在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作用下分裂成2125bp的成熟miRNA。成熟的miRNA是具有约22nt的5为单磷酸基、3为羟基的单链RNA。miRNA与相关蛋白质结合成另一种RISC复合体,RISC复合体通过和靶mRNA结合,从而导致mRNA的降解或抑制基因的转录。植物miRNAs明显特征是剪切靶mRNA,如miR172,主要功能是作为翻译抑制子。,RNAi技术概述,RNAi引起基因沉默的途径,植物RNAi表达载体的构建,RNAi技术在植物上的应用,RNAi存在问题与展望,Text1,Text2,Text3,Text4,Text5,Contents,3植物RNAi表达载体的构建,3.1转基因RNAi载体构建的关键因素在强组成型启动子下游插入反向重复片段的重组双元载体是导致RNA沉默的基本结构。在该载体中,目标基因的cDNA片段被克隆在间隔序列(spacer)的两端,这些片段通过头头相连或尾尾相连导致该转基因产生自我互补的hpRNA(分子内dsRNA)结构。,内含子有无在转录时通过拼接产生功能性间隔(spacer)内含子在介导基因沉默比无功能性的内含子更有效。形成带有内含子的ihpRNA载体，其沉默效率比hpRNA高达90%以上。启动子强弱启动子强弱对于外源基因的表达水平有重要的影响。CaMV35S启动子已广泛应用于双子叶植物中,但在水稻、小麦等禾本科植物中可用泛素Ubiquitin启动子等,以提高载体的干扰程度。目的片段大小目的片段大小的选择也十分重要。Helliwell和Waterhouse在构建载体时选择50bp1kb的目的片段都成功地导致了目的基因沉默。但是发现较短的片段效率较低,较长的发夹结构在寄主细菌中容易重组。Helliwell建议采用300bp600bp大小的片段更容易获得比较有效的基因沉默。,3.2RNAi载体构建的过程,3.2.1目的片段的克隆以植株的DNA为模板,用带特定酶切位点的引物进行PCR扩增,然后将PCR产物克隆到T载体上3.2.2表达载体的构建正义基因片段和纯化的质粒片段连接带有正义基因片段的质粒载体与反义片段连接双元表达载体,RNAi技术概述,RNAi引起基因沉默的途径,植物RNAi表达载体的构建,RNAi技术在植物上的应用,RNAi存在问题与展望,Text1,Text2,Text3,Text4,Text5,Contents,4RNAi技术在植物上的应用,4.4植物品种改良中的应用,4.3植物雄性不育的研究,4.2植物抗病性的研究,4.1植物基因功能的研究,4.1植物基因功能的研究,Chuang等在花发育研究中采用RNAi技术进一步验证了AG,CLV3,AP1,PAN等已知功能基因,并开创了RNAi技术在植物功能基因组学中的应用。,Fig.1.GeneconstructsusedtoanalyzedsRNAeffects.,Fig.2.Flowersofwild-type,ag-1andAG(RNAi)plants.,Fig.4.EffectsofAGdsRNAonlevelsofAGmRNAandAGprotein,Fig.3.Phenotypesofwild-type,CLV3(RNAi),andclv32plants.,Fig.5.EffectsofPANdsRNAoncrc-1transgenicplants.(AandD)crc-1.,3,4,5,2,RNAi在基因家族方面的研究,Miki等(2005)等将水稻OsRac基因家族的7个成员通过RNAi技术分别被特异抑制,把基因家族成员的3-非转译区(3-UTR)作为反向重复序列构建RNAi载体,其中3个成员被高效抑制。同时将OsRac基因家族中高保守性强的序列构建RNAi载体,结果不同效率地抑制了所有成员基因的表达。这个结果显示RNAi技术在研究基因家族的有效性。,RNAi技术研究多倍体植物功能缺失,研究表明,在真菌、动物和植物中的RNAi是生物抵御病毒侵染的一种古老的生理机制。Richard等在四倍体植株中成功地运用了RNAi技术。用拟南芥着丝点甲基化相关的dsRNA对拟南芥的四倍体进行RNA干扰,发现拟南芥的四倍体中对应的着丝点脱甲基化,拟南芥四倍体中对应的与甲基化有关的mRNA含量水平剧减。最近,Travella等在构建的PDS-RNAi和EIN1-RNAi的六倍体小麦转基因作物中,成功的抑制了目的基因。研究证明,RNAi技术是研究多倍体植物功能缺失突变很好的工具。,4.2植物抗病性的研究,1998年,首次报道RNAi技术在防治马铃薯Y病毒抗病的应用,利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建IRS载体进行烟草转化,使植株完全免疫。根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)引起的根癌病危害着许多多年生水果、坚果和观赏性植物。研究发现iaaM和ipt2个基因在这个疾病中起重要作用。采用RNAi技术,在拟南芥和番茄中沉默iaaM和ipt2个基因成功地抵抗了根癌病。,4.3植物雄性不育的研究,刘乐承等人采用RNAi技术下调了白菜BcMF4基因的表达，导致了菜心转基因植株部分花粉的不育，证明BcMF4基因在普通白菜和菜心等白菜植物的花粉发育中起着重要作用.,Cigan等利用RNAi技术直接沉默玉米的花粉囊基因表达的启动子MS45,从而抑制花粉囊的形成,形成玉米的雄性不育株;利用不同的启动子使已经沉默的启动子MS45重新表达,玉米植株重新恢复育性。,4.4植物品种改良中的应用,日本生物技术研究所使用RNA干扰花色素苷和类黄酮生物合成的关键酶查耳酮合成酶(CHS)基因,成功地将花由原先的蓝色转变为白色和粉色,创造了新的商品花卉。Ogita等利用RNAi抑制咖啡因合成酶(theobrominesynthase)基因的表达,结果咖啡因含量降低了57成。Liu(2002)等利用RNAi技术对棉籽油的成分进行改良,应用RNAi技术下调两个主要脂肪酸脱氢酶基因的表达,从而将棉籽油中的高油酸和高硬脂含量水平降低.利用RNAi通过敲除22kD玉米贮藏蛋白的表达，培育出高赖氨酸玉米品种(segaletal.，2003)。Ganga等(2005)采用果实特异启动子结合RNAi技术来抑制番茄内源光形态建成调节基因DET1的表达,结果类胡萝卜素和类黄酮含量明显升高,而果实的其它品质参