课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

尿素分子的立体结构,CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3,脲酶,课题2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、研究思路,美国黄石国家公园的一个热泉,（一）筛选菌株,水生耐热细菌Taq(Thermusaquaticus)耐高温的TaqDNA聚合酶美国微生物学科布鲁克1966年发现耐热细菌,1、实验室微生物的筛选原理（P21）,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,（一）筛选菌株,一、研究思路,2、选择培养基,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。,（一）筛选菌株,一、研究思路,加入青霉素的培养基细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物,1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？,碳源是葡萄糖，氮源是尿素,2.分析该配方的培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，又是如何进行选择的？,有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。,阅读22页本课题使用的培养基配方,（二）微生物计数,1、显微镜直接计数法,1mm,一、研究思路,每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。,1mm,下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数是多少?1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）,5AB104,5A,缺点：不能区分死菌与活菌,2、统计菌落数目稀释涂布平板法,（二）微生物计数,平板菌落数统计注意事项,1、几个菌落粘连一起，只要肉眼能区分，就算几个；2、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数；3、菌落数目过多时，可以合理采用样方法。,某班级菌落数统计表格,平板,组别,恰当的稀释度、正确的涂布操作是成功地统计菌落数目的关键。,（取样0.1mL,稀释倍数106）,思考1：如何根据平板上的菌落数推测出每mL样品中的菌株数？,统计某一稀释度下平板上的菌落数，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按公式每mL样品中的菌株数=（CV）M进行计算。,思考2：统计的菌落数往往比活菌的实际数目高还是低，为什么？,低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。,思考3：为了增强实验结果的说服力和准确性，我们在实验设计时应该怎么做更合理？,实例分析1,第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与另外2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。,想一想：哪位同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,（三）实验基本原则,1、平行重复原则,一、研究思路,实例分析2,想一想：A同学和其他同学所得实验结果差异如此之大，请分析原因可能有哪些？,实例分析2,想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？,一种方案：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,实例分析,想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？,另一种方案：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的！,实例启示,设置对照实验的目的是什么？,排除实验操作、培养条件等无关变量对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,（三）实验基本原则,1、平行重复原则,2、对照原则,3、单一变量原则,一、研究思路,实验名称：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验原理：实验目的：材料用具：方法步骤：1、分组编号2、处理（遵循实验设计的基本原则）对照原则、单一变量原则（等量原则）科学性原则、平行重复原则可行性原则3、观察记录（设计观察记录表）实验预期：实验结果的分析与评价：实验结论：,设计时请利用P23-P24的三个资料,二、实验设计,二、实验设计,（对照原则、单一变量原则、平行重复原则）,资料一.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,二、实验设计,资料二.样品的稀释,将样品液稀释，选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30-300之间，适于计数的平板。,分离不同的微生物能采用相同的稀释度吗？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,答：不能。这是因为土壤中各类微生物的数量是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,思考题,资料二.样品的稀释,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。,将样品液稀释，选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30-300之间，适于计数的平板。,将涂布好的培养皿放在30温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。以表格的形式记录选择培养基中不同菌落的特征。,资料三.微生物的培养与观察,一无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三规划时间,三、操作提示,1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？,四、结果分析与评价,CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3,pH升高指示剂（酚红）将变红,五、课题延伸,方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。,脲酶,滤膜法,以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上培养。在