chap基因操作常规技术

第四章 基因工程的常规技术,分离检测分子杂交PCR技术,DNA测序 基因定点突变 DNA与Pr互作,4.1 核酸的分离与检测,gDNA的分离质粒DNARNA的分离,细胞破碎去蛋白DNA沉淀,4.1.1 gDNA的提取,SDS法酚抽提法CTAB法,CTAB法,高盐: 溶解低盐: 沉淀蛋白、多糖分离NaAc-70% alc,如何保持CS-DNA的完整性?,物理降解内源DNasepH7,4.1.2 质粒DNA的分离纯化,拓扑学的差异 gDNA大, 易解旋质粒小, ccc状态,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,1. CsCl密度梯度超离心,密度梯度沉降=扩散浮力密度差样品+EB,样品BD = 该位置上的CsCl密度,位置分布: 沉降速度、 MW及离心时间,Sol I; II; III,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,2. 碱变性法,pH12: 变性程度pH7: 复性速度离心: 收集?,3. 沸水浴法,加酶破壁 沸水浴40 s离心Eth沉淀,4.1.3 RNA的提取,原理,酚-异硫氰酸胍,防止RNA降解的措施,DEPC处理RNasin专用无菌台器皿、手套、口罩低温操作,4.1.4 核酸质量检测,紫外光谱法凝胶电泳法,ssDNA=33(A260A310) 稀释dsDNA=50(A260A310) 稀释ssRNA=40(A260A310) 稀释,荧光分析法二苯胺显色,分子筛; 电荷效应UVEB荧光,凝胶电泳技术,凝胶成像系统,Rf、分辨力的影响因素,大小, 构型gel浓度电压、时间buffer,凝胶浓度 片段大小/kb 0.3 560 0.6 110 0.7 0.820 1.0 0.58 1.2 0.46 1.5 0.23 2.0 0.12,缓冲液及其pH,TBE: 缓冲力大长 : TAETBE短: TAE分辨力低,如何防止pH和离子强度改变?,RNA的检测,A260变性胶28S4.5 kb18S2.1 kb,PAGE,尿素buffer: 0.51TBE同位素或荧光标记测序、多态性分析,40kb: Rf与分子大小无关交替改变的电场,线团束状,脉冲场凝胶电泳,改变形状所需时间不同胶孔中摩擦力不同,脉冲电场电泳示意图,垂直交变电场系统,场翻转系统,箝位匀强电场系统,旋转胶系统,影响分辨率的因素,脉冲时间(0.1s-1000s): 长脉冲,大片段电压: 场强,最大片段范围电场夹角: 110120温度: 4,4.2 分子杂交技术,Southern blotNorthern blotWestern blot,dot blotFISH菌落原位杂交,4.2.1 探针与探针标记,寡核苷酸片段ss or ds足够长度不含互补区,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+ 5dNTP 5ppp dA(-32P-dATP),5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,DNase I,DNA pol I,1. 探针的标记,随机引物标记,5末端标记,5 HO,OH 3,OH 5,T4-PNK,Mg2+ pppATP (-32P-dATP),5p,p 5,3 HO,3 HO,OH 3,2. 标记物及其检测,标记物及性质 标记方法 杂交体检测法地高辛: DIG RPL 酶标抗体-底物显色生物素: Bio-16-dUTP NT,TL,PCR 酶标亲合素显色荧光素: 罗丹明,FITC 合成法 荧光显微镜,放射性标记,非放射性,地高辛系统标记,dUTP-连接臂-甾醇半抗原,DIG,抗体-显色酶交联复合物,生物素标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,显色酶,Biotin,Avidin,烷烃连接臂,生色底物,颜色产物,荧光素标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,荧光素,Biotin,Avidin,烷烃连接臂,4.2.2 Southern杂交,质粒鉴定、基因位置、分子诊断,酶切和电泳法可以吗?,4.2.3 Northern杂交,样品, 电泳, 探针不宜碱变性勿低盐buffer洗膜胶中无EB,4.2.4 Western杂交,电泳, 印迹, 免疫学主要步骤SDS-PAGE, blot杂交(AP或HRP),Semi-dry transfer system,斑点杂交,4.2.5,Allele-specific oligonucleotide (ASO) dot-blot hybridization can identify individuals with the sickle cell mutation. The schematic dot-blot at top shows the result of probing with an ASO specific for the normal -globin allele (A-ASO). The results are positive (filled circle) for normal individuals and for heterozygotes but negative for sickle cell homozygotes (dashed, unfilled circle). The dot-blot at the bottom shows the result of probing with an ASO specific for the sickle cell -globin allele (S-ASO), and in this case the results are positive for the sickle cell homozygotes and heterozygotes but negative for normal individuals. The A- and S-ASO were designed to be 19 nucleotides long in this case chosen from codons 3 to 9 of respectively the sense A and S globin gene sequences surrounding the sickle cell mutation site. The latter is a single nucleotide substitution (AT) at codon 6 in the -globin gene, resulting in a GAG (Glu)GTG (Val) substitution (see middle sequences).,制片探针制备杂交镜检、拍照,4.2.6 FISH杂交,基因检测新技术使膀胱癌确诊提前,“FISH技术在膀胱癌检测中的临床应用研究”,为期2年,对4809例患者开展了临床检测实验.结果:比临床常规检查,膀胱癌确诊提前36 m杂交探针和检测试剂已实现国产化,质量稳定可靠,价格比进口产品降低近七成,4.2.7 菌落(斑)原位杂交,阳性重组子检测菌落 ?文库菌斑 ?文库,4.3 PCR扩增技术,链式反应动物单拷贝G,Since its discovery in 1983 the polymerase chain reaction has revolutionized molecular biology. Today, new forms of PCR and the related techniques of cloning are finding new applications at the cutting edge of biomedicine.,4.3.1 基本原理,离体合成几何级数平台效应,4.3.2 反应体系,模板引物Taq 酶dNTPs缓冲液,DNA or mRNA模板纯度数量,引物的设计,1630 nt, GC含量连续互补碱基3 3正确配对5可被修饰简并引物,耐热的DNA pol,Taq酶Pfu酶35校读高保真,缓冲液,pH、离子强度Mg2+,酶活Mg2+,非特异引物退火,4.3.2 基本过程,变性退火延伸,扩增精确性的影响因素,引物: 1 mol/LdNTPs: 20200 mol/LMg+2: 0.52.5 mmol/Lhot start,4.3.3 PCR技术的改进,nested PCRinverse PCRanchored PCR,RT-PCRin situ PCR实时定量PCR,1. 巢式PCR,嵌套引物外引物内引物,2. 反向PCR,X、Y未知序列酶R消化环化再酶切扩增,反向PCR的特点,难选适当的限制酶扩增的长度有限自身环化效率低,3. Anchored PCR,锚定引物A扩增产物鉴定,特点,扩增未知序列无需酶切及连接操作简单特异性高,4. RT-PCR,5. 原位PCR,原位扩增, 杂交, 定量不需抽提模板灵敏度高100,病毒检测、肿瘤发生率,通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时监测,实现对起始模板定量分析的方法,6. 实时荧光定量PCR,FRET技术; 荧光标记探针扩增、杂交、光谱、实时检测荧光信号积累,起始模板量,荧光定量PCR的原理,起点定量与终点定量,荧光扩增曲线的三个阶段,背景信号阶段,指数扩增,平台期,几个参数的确定,临界点循环数(Ct)标准曲线,基线阈值Ct值DNA0,阈值缺省: 3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,Log浓度与循环数的关系,起始数越多,Ct值越小标准曲线样品Ct值初始模板量,DNA产物的荧光标记,非特异性荧光标记SYBR Green I特异性荧光标记TaqMan探针分子信标, SYBR Green法,只有和dsDNA结合后才发荧光变性时,DNA双链分开,无荧光,延伸结束阶段采集荧光信号与非特异的dsDNA结合发光,必须在反应结束时做融解曲线分析,SYBR Green融解曲线分析,PCR反应体系的建立及优化,染料:太高抑制Taq酶活性;太低,荧光信号太弱,不易检测引物:扩增有杂带,定量不准Mg2+:1.5mM,减少非特异性产物T & T:由酶和引物决定,SYBR Green法优缺点,对模板无选择性使用方便,无需探针灵敏;便宜,非特异性结合,产生假阳性对引物特异性要求较高,5-R; 3荧光淬灭基团(Q)探针完整,R发射的荧光能量被Q吸收,无荧光; R与Q分开,发荧光Taq酶: 53外切酶活性, TaqMan法,TaqMan水解型杂交探针原理,当一个荧光分子(供体)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体)的激发光谱相重叠时,供体荧光分子自身的荧光强度衰减,FRET,荧光共振能量转移,扩增1条DNA释放1个荧光分子荧光信号的累积与PCR产物同步,TaqMan法PCR反应的建立,PP的设计: 探针Tm为70,30bp, 5非G; 引物Tm为60反应参数: 95 3, 94 15s, 60 60s,40循环PP优化:获得最小Ct值,最大信号/背景比值primer: 50-900nM; probe: 50-250nM,TaqMan法优缺点,对目标序列的高特异性引物设计相对简单重复性比较好只适合一个特定的目标委托公司标记,价格较高, 分子信标,与扩增产物结合产生荧光,信号的强弱靶序列的多少,发夹型荧光探针,R与Q接近,产生FRET探针-模板配对,构象改变R与Q分离荧光,荧光定量PCR的特点,实时检测特异性强定量精确无需跑胶,4.4 DNA测序,化学降解法末端终止法,G反应: DMS使G、A甲基化G+A: 哌啶使G断裂T+C: 肼使嘧啶环断开,哌啶除去碱基C反应: 高盐下,仅C与肼反应,C末端,1. Maxam-Gilbert化学降解法,距标记末端250nt非酶促合成测序,无需引物对合成的寡核苷酸测序蛋白质与DNA的相互作用,特点,2. Sanger酶学法,基本步骤,模板纯化测序反应,模板,引物, Pol, dNTPs (dd)4个反应4组产物 PAGE自显影X光片,上样电泳放射自显影,测序与PCR的比较,测序 PCR引物 1条 1对合成 线性 指数底物 dNTP和dd dNTP产物 系列长度片段 1条带,3. DNA全自动测序,同位素标记荧光标记单色荧光多色荧光,时间长序列短污染大操作难,放射自显影胶图,多色荧光标记,dNTP,ABI Prism 3100-Avant,遗传分析仪的多种应用,基本步骤,模板的纯化与定量测序反应PCR仪产物的纯化与变性上样电泳测序仪结果分析,Automated DNA sequencing with fluorescently labeled ddNTP. (A) The chain termination reactions are carried out in a single tube, with each ddNTP labeled with a different fluorophore. In the automated sequencer, the bands in the electrophoresis gel move past a fluorescence detector, which identifies which ddNTP is present in each band. The information is passed to the imaging system. (B) The printout from an automated sequencer. The sequence is represented by a series of peaks, one for each nucleotide position. In this example, a green peak is an A, blue is C, black is G, and red is T.,4. DNA测序技术进展,传统测序技术的缺陷及新进展,序列不可能太长费时费力准确度不高结构复杂序列,杂交法质谱法DNA芯片法单分子法,4.5 DNA的定点诱变,盒式取代切除; 合成; 转化olig介导PCR诱变,olig片段退火合成转化,olig介导的诱变,Oligonucleotide mismatch mutagenesis can create a desired point mutation at a unique predetermined site within a cloned DNA molecule,PCR诱变,4.6 DNA与蛋白质互作分析,Y2H systemY1H systemgel retardation assaysDNase I footprinting,1. 酵母双杂交(Y2H),GAL4 proteinBD与UAS结合AD激活lac Z单独不起作用,GAL1 UAS,启动子,lac Z reporter,GAL1 UAS,启动子,lac Z reporter,X,GAL4BD,GAL1 UAS,启动子,lac Z reporter,Y,GAL4AD,A,B,重组质粒的构建,穿梭载体GAL4菌,GAL1 UAS,启动子,lac Z reporter,X,GAL4BD,Y,GAL4AD,转录,C,GAL1 UAS,启动子,lac