常用分子生物学技术

常用分子生物学技术,侯桂琴郑州大学药学院,一、分子生物学技术在新药研究中的应用,1.生物技术药物2.靶向制药3.抗体工程制药4.药物筛选,二、常用分子生物学技术,1.基因重组2.PCR技术3.分子杂交技术4.基因芯片技术,（一）基因重组,基因重组（DNA Recombinant），也称基因克隆（Gene Cloning）,指在生物体外对不同来源的DNA 分子进行剪切和连接，形成新的重组DNA分子并将其导入受体细胞，使其在细胞中稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA。,基因重组流程,1.目的基因的制备,目的基因又称外源基因，即我们感兴趣的待研究基因，其表达产物可能有较大的经济或社会效益。主要来源于各种生物。人、动植物染色体；线粒体、叶绿体。,需要克隆的DNA片段：,化学合成法,cDNA文库基因组DNA文库,聚合酶链式反应,2.用限制性内切酶切割目的基因和载体,载体（Vector）:指能够将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具。其本质是DNA。常用载体有质粒载体、噬菌体病毒载体或染色体DNA改建成的载体。工具酶：DNA重组包括分子切割及连接等需要多种不同功能的工具酶参与完成，如限制性内切酶、DNA连接酶（“分子针线”）、DNA聚合酶等。,3.用DNA连接酶连接酶切后的目的基因和载体，构建DNA重组子,连接方法：粘末端连接、平末端连接、同聚物加尾连接、人工接头连接、衔接物连接法。,4.将DNA重组体导入宿主细胞,目的基因序列和载体连接后，要导入细胞中才能繁殖扩增，在经过筛选，才能获得重组DNA克隆。不同载体在不同宿主细胞中繁殖，导入细胞的方法也不相同。方法有转化、转染、感染、显微注射等。,5.重组体的筛选鉴定,将众多的转化菌落、噬菌斑或细胞区分开，并签定其缺失含目的基因的重组体的过程称为筛选。 目的基因和载体重组进入宿主后，由于操作原因或不可预测的干扰等，目的序列与载体正确连接的效率和重组导入细胞的效率都不是100，因此最后生长繁殖出来的细胞并不都带有目的序列，真正获得目的基因并能有效表达的克隆分子知识其中一小部分，绝大部分仍是原来的宿主或不含目的基因的重组体。,6.目的基因在宿主细胞中扩增和表达,指被克隆如某一载体的目的基因经转录和翻译生产蛋白质的过程。某些具有特定生物活性的蛋白质在医学或工业上都有很大的价值。如疫苗、干扰素等。,（二）PCR技术,1985年，美国人Kary Mullis 获1993年诺贝尔化学奖,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。,1.原理,包括三个步骤：,模板DNA的变性（denaturating）模板DNA与引物的退火(复性)(annelling) 引物的延伸 (extension),标准反应体系： 总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶,2.PCR技术基本操作,PCR技术的基本过程(1),模板DNA dNTP 引物Buffer,（1）预变性,模板DNA dNTP 引物Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC 5,基本过程：,PCR技术的基本过程(2),Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer,9455 72 ,Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer,（3）延伸 72 57 min,（2）循环过程,实时荧光定量PCR仪,梯度PCR仪,普通PCR仪,3.扩增产物分析：,凝胶电泳分析酶切分析 分子杂交 核酸序列分析,设计原则： 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在1530碱基之间。 G+C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。 引物3端要避开密码子的第3位。,4.PCR引物设计,设计方法：1.采用引物设计软件进行设计，如primerprimer5.02.依照设计原则自行设计,例1：用软件设计(Primerprimer5.0),3.几种常用PCR技术一般PCR荧光定量PCR逆转录PCR （RT- PCR ）多重PCR （Multiple PCR ） 巢式PCR （nested PCR ） 非对称PCR （asymmetric PCR）原位PCR技术,(三) 分子杂交技术,1.基本原理,核酸分子杂交的基本原理：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。,2.常见杂交方式,(1) Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。 (2) Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。 (3) Western 杂交：蛋白质分子检测,在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因 此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。,3.分子杂交的基本方法,Southern 印迹法Northern 印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western 印迹法液相杂交,固相杂交,(1)Southern blotting,1975年，英国Edwen Southern创建检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析、基因诊断、分子克隆、法医学等,Southern bloting的主要步骤,1.待测DNA样品的制备、酶切2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中DNA的变性：碱变性4.Southern转膜(印迹)：5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测,核酸的分子杂交,将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。,杂 交 模 式 图,Southern Blotting的过程1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA3.固定胶中的DNA4.预杂交、杂交（放射性和荧光检测5.结果检测,1.待测DNA样品的制备、酶切DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释放，用TE液溶解，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质标准程序：酚酚-氯仿氯仿。,步骤,分离目的序列与非目的序列,2.待测DNA 样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳,bp1534 994 695 515 377 237,A B C M,琼脂糖凝胶电泳,3.凝胶中DNA的变性：碱变性4.Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法,电转印法,5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测,（2）Northern blot,检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNA，不需用限制酶消化RNA电泳转膜：电泳结束后不需变性应用：检测外源基因在宿主中能否转录,RNA提取1.样品细胞的有效破碎 2.使核蛋白复合体变性 3.对内源RNA酶的有效抑制4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离,（3）斑点印迹杂交(dot bloting),将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多个样品应用：确定DNA样品之间的同源性,（4）核酸原位杂交(in situ hybridization),1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法。2.特点：能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,核酸原位杂交的基本步骤,1.细胞或组织的固定：载玻片2.组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质3.探针的选择和标记4.杂交5.杂交结果检测,1.荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。 2.多色荧光染色体原位杂交(multicolor FISH; mFISH ),由原位杂交发展起的一些新技术,3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH ) 利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的Genomic DNA ，再同时与正常的染色体进行hybridization，染色体上不同荧光间的强弱比值，由此比较而观察基因组中特定基因的拷贝数变化。 CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在染色体上定位。该方法通过同一次实验即可扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。,（5） Western 印迹法(Western bloting),根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。,主要步骤：蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应,（6）液相杂交,待测核酸分子与探针在杂交液中进行反应， 分离杂交双链和单链RNA，再进行检测。RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法,4. 探针的标记,探针的种类标记物探针标记方法探针的纯化,探针的种类：cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针,标记物：核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等非核素