当归总黄酮提取工艺及体外抗氧化性研究

当SINENSISOLIVDIELS的干燥根。当归根人药，有补血活血、调经止痛、润肠通便和调控免疫活性的功效【21。临床用量大，出口量大，主产甘肃岷县、渭源、陇西、宕昌等地I。其主要成分有挥发油、多糖、阿魏酸等41，此外还含少量钾、钙、镁、锌、硒等微量元素。近年来，对当归的深度开发在医药、保健品和化妆品领域取得了一定成效。当归的主要功能成分一直被认为是挥发油和阿魏酸，近年来国内外医学专家研究发现当归还有抗缺氧、抗癌、康肤美容、补血活血、抑菌、抗动脉硬化作用等I51。黄酮是广泛存在于自然界的一大类化合物，存在于植物的所有部分，包括根、心材、树皮、叶、果实和花中。其在植物体内大部分与糖结合成苷类，小部分以游离态苷元的形式存在【。黄酮类化合物大多具有颜色，在生理方面具有降低心肌耗氧量、增加冠状动脉和脑血管血流量、增加机体免疫功能、抗心律失常、软化血管、降血糖、降血脂、清除机体自由基和抗衰老等作用I7I。笔者等以甘肃陇南当归为对象，考察其提取工艺及抗氧化性，为当归的进一步开发利用提供科学依据。1材料与方法11原料及处理方法当归采自甘肃陇南。将当归根经自来水、蒸馏水洗净，烘干，粉碎过60目筛，备用。12主要试剂邻苯三酚美国SIGMA公司；TRIS加拿大BIOBASIC公酸、30过氧化氢、I氯乙酸TCA、磷酸缓冲液PH值为740，PH值为660PBS、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铁、铁氰化钾等试剂均为分析纯；试验用水为三蒸水，所用仪器均经自来水、三蒸水清洗备用。13主要仪器GB204电子天平梅特勒一托利多仪器上海有限公司；RE一52C型旋转蒸发仪巩义市英峪予华仪器厂；SHZD1LI循环水式真空泵巩义市予华仪器有限责任公司；DK一98一型电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司；WFJ一2100型分光光度计尤尼柯上海仪器有限公司；LAMBDA系列紫外可见分光光度计美国PERKINELMER公司；800型离心沉淀器上海手术器械十厂；YLD一2100电热恒温鼓风干燥箱上海琅歼实验设备有限公司。14黄酮含量测定原理及鉴定方法141测定原理黄酮类化合物主要包括黄酮苷和黄酮醇苷两大部分。在黄酮类化合物溶液中加入铝离子试剂后，黄酮类化合物中的酚羟基与AL生成络合物，控制适宜的PH值，所生成的络合物在可见区能获得特征吸收峰，其质量浓度与吸光度符合朗伯一比耳定律，可以定量测定8。142金属盐类试剂的络合反应盐酸一锌粉反应在样品液中加入少量锌粉，再滴加12滴浓盐酸，在沸水中加热3MIN，观察反应结果。铝盐反应在样品液中滴加10A1C1，溶液，观察反应结果。浓硫酸反应在样品液中滴加少量浓H2SO溶液，观察反应结果。硝酸铅反应在样品液中滴加10PBNO，溶液，观察反应结果。氢氧化钠反应在样品液中滴加4NAOH溶液，观察反应结果。143单因素试验分别以提取温度、乙醇浓度、提取时间、料液比为影响因素，设置4个因素的不同水平，以确定相关因素对当归提取液中总黄酮含量的影响。调查研究152标准曲线的绘制1521芦丁标准溶液的配制准确称取105OC常压干燥至恒重的芦丁标准品100MG，用少量75乙醇加热溶解，待冷却后转移至50ML的容量瓶中，定容至刻度，充分混匀。芦丁标准品的浓度为02000RAGME，备用。1522测定波长的选择按上述方法制备标准溶液，以不加标准溶液的相应溶液为空白，在波长400760NM进行连续扫描。结果在波长509NM处有最大吸收，因此选择509NM为测定波长。1523标准曲线的绘制精确吸取芦丁标准溶液0O0、050、1O0、150、2O0、250、3O0、350ML，分别置于10ML的具塞试管中，先加5亚硝酸钠溶液040ML，摇匀，静置6MIN；再加10硝酸铝溶液040ML，摇匀，静置5RAIN；最后加入4氢氧化钠4O0ML，用75乙醇定容，摇匀，静置15RAIN，以芦丁试剂空白作参比，用分光光度计于509NRFL处测定吸光度。153回收率试验精密量取一定量在最佳提取工艺条件下的当归总黄酮提取液，加入02000MGML芦丁标准液1O0ML，最后定容至10ML。测量吸光度，计算黄酮回收率。154精密度试验根据正交试验的分析结果，依照最佳提取工艺进行提取，对当归样品平行提取5次，测定黄酮含量，计算精密度。16体外抗氧化性试验16I提取液对羟基自由基的清除效果按照SMIMOFF的方法，利用H0与FE“混合，产生OH，在体系内加人水杨酸捕捉OH，并产生有色物质，该有色物质在510RIM下有最大吸收，故通过测定A。值可以定量判断OH的清除程度，并可以估算出OH的清除率。取不同量一定浓度的提取液，加入9O0MMOLLFESO41O0ML，9O0MMOJL水杨酸一乙醇溶液1O0ML，再加880MMOLLH01O0ML，用蒸馏水补至500ML，于37下反应30MIN，以蒸馏水作参比测定A。值A，以9MMOLLFESO41O0ML，9O0MMOLL水杨酸一乙醇溶液1O0ML，移取一定量提取液，用蒸馏水补至5O0ML，于37下反应30RAIN作为本底吸收值A蚰，以9MMO1LFESO1O0ML，9O0MMOLL水杨酸一乙醇溶液1O0ML，蒸馏水1O0ML，880MMO1LH2021O0ML，用蒸馏水补至5O0ML，于37下反应30RAIN作为空白A0，均测定其A，。值。按以下公式计算自由基清除率CCAOAXAXO100A0162提取液对超氧阴离子的抑制作用I111在碱性条件下PH值820邻苯三酚发生自氧化反应，生成02_和有色中间产物，该有色产物在322NM处有一特征吸收峰。当加入0一清除剂时，0一的生成被抑制，邻苯三酚自氧化速率受阻，溶液在322NM处吸收减弱，故通过测定A值可以推测提取物对02的清除作用，并比较不同提取物添加量对02清除作用的相对大小。取3支10ML比色管，各加入PH值820的TRISHCI溶液2O0ML，再依次分别加入0O0、050ML一定浓度提取液LE和02MGML抗坏血酸溶液050ML，最后均加02MMOLL邻苯三酚溶液1O0ML，加水定容至刻度，在波长322NM处以时间模式记录45RAIN内每隔30S吸光度的变化。另取10支10ML比色管，各加PH值820的TRISHC1溶液2O0ML，再依次分别加入0O0、020、040、O60、080、100、120、140、160、180和2O0ML一定浓度的提取液LE，最后均加02MMOLL邻苯三酚溶液1O0ML，加水定容至刻度，在波长322ILM处以时间模式记录5RAIN内每隔30S吸光度的变化，并计算提取液对超氧阴离子自由基的抑制率。抑制率按下式计算抑制率A，T一ATATX100式中AZXT为邻苯三酚自氧化速率，AT为加入提取物以后邻苯三酚自氧化速率。163提取物还原力的测定普鲁士兰法【I2】。吸取不同量一定浓度的提取液，分别加入02MOLLPH值66的磷酸盐缓冲液和浓度为1KFECN溶液各250ML，混合均匀，混合液在5O水浴中保温20RAIN后，加10的TCA溶液250ML，混合后3000RRAIN离心10RAIN。取上清液250ML，加蒸馏水250ML和01FECI3溶液050ML。测定反应液在700AM处吸光度值，用吸光度大小表示还原力强度。2结果与分析21黄酮类化合物的鉴定显色反应结果见表2，表明当归中含有黄酮类化合物。表2显色反应结果结果浅黄_橙红轻微浑浊浅黄亮黄浅黄_红褐色浅黄J向色絮状沉淀22单因素试验221料液比的影响准确称取1O000G当归样品于100ML圆底烧瓶中，在提取温度为60，提取时间为2H，乙醇浓度为65，提取次数为3次条件下，经旋转蒸发仪浓缩至浸膏状，冷却后定容至100ML容量瓶，分析料液比对提取当归中总黄酮的影响。结果见图1。由图I可以看出，当料液比为140时，吸光度达到最大值，说明总黄酮含量达到峰值。当继续增加料液比时，吸光度反而下降，可能是料液比增加到一定程度时，原料内部与溶剂之间溶质已经达到平衡，反而使杂质溶解增加，相应降低了吸光度值”1。料液比图1料液比对当归总黄酮提取量影响222乙醇浓度的影响准确称取10000G当归样品于100ML圆底烧瓶中，在提取温度为60，提取时间为2H，料液比为140，提取次数为3次的条件下，经旋转蒸发仪浓缩至浸膏状，冷却后定容至100ML容量瓶，分析乙醇浓度对提取当归中总黄酮的影响。结果见图2。由图2可以看出，当乙醇浓度为75时，吸光度达到最大值，说明总黄酮含量达到峰值。当继续增加乙醇浓度，吸光度反而下降。实验结果表明，以75乙醇进行提取为宜。5505口掣群0_。D0455055B0557075目085乙醇浓度图2乙醇浓度对当归总黄酮提取量影响223提取时间影响准确称取10000G当归样品于100ML圆底烧瓶中，在乙醇浓度为75，提取温度为60，料液比为L40，提取次数为2次的条件下。经旋转蒸发仪浓缩至浸膏状，冷却后定容至100ML容量瓶，分析提取时间对提取当归中总黄酮的影响。结果如图3所示，随着提取时间的延长，吸光度逐渐增加，但是3H以后吸光度反而下降。224实验04督口42图3提邱100ML圆料液比为仪浓缩至温度对提以看出，阳度达到类物质在高温下遭到破坏，或者其它杂质被提取出来，不利于进一步的分离纯化IL41。O10203040507O901OO提取温度C图4提取温度对当归总黄酮提取量影响23标准曲线与回归方程见图5。OO01012000005006O07口舶芦丁浓度MG图5标准回归曲线24正交试验采用3正交试验对当归提取液进行分析，以黄酮提取量为指标，研究各因素间相互作用下的最佳提取工艺。结果见表3。调查研究取时间为35H，料液比为130，提取次数为2次。在此工艺条件下得到的总黄酮提取量为94642MGG。25精密度试验结果见表4。表4精密度试验结果黄酮含量RAG921368578887792949768879589897404由表4相对标准偏差分析可得RSD为404，在此工艺条件下得到的总黄酮提取量高，精密度良好。26回收率试验由表5试验结果可得，平均回收率为9951，说明该方法的回收率高，适合工业化生产。表5回收率试验结果06236O657O02769O267703L8702N2020202O8236O857O0I4769O467705L870834108424046L50463205300L01_2798_309677995L99O31021327体外抗氧化性试验结果271提取液对羟基自由基的清除效果试验结果表明，当归黄酮对羟自由基OH的清除率随着添加量的增加而增加，当提取液总黄酮浓度为0068MGML时，清除率可达到7402，说明提取液对羟自由基有较好的清除作用。而且总黄酮浓度与清除率基本呈线性相关，见图6。提取液体积X与清除率Y关系的回归方程为Y一3904117540107XR099655000001O02O03O04O05006007浓度NAGML图6当归总黄酮提取液对OH的清除效果272提取液对超氧阴离子的抑制作用结果见图7。由图7可见，当加入一定的提取液后，随着时间的推移，邻苯三酚自氧化曲线明显降低，说明提取液对邻苯三酚的自氧化有明显抑制作用。图7邻苯三酚自氧化曲线试验结果表明，当归黄酮对超氧阴离子O一的清除率随着添加量的增加而增加，当提取液总黄酮浓度为0034MGML时，抑制率可达到5179，说明提取液对OZ一有较好的抑制作用，见图8。且总黄酮浓度X与抑制率Y呈线性相关Y4266139925134XRO99558。1JJI，一000000D口0O23O00，5浓度RAGML图8当归总黄酮提取液对邻苯三酚自氧化抑制作用阳帅如仲0锺察醉器嚣273提取物还原力测定当归黄酮具有良好的还原能力。图9结果表明，随着提取液加入体积的增大，还原力逐渐增强。当加入008MGML提取液2O0ML时，吸光度为0566，说明黄酮是良好的供电子基团。黄酮供应的电子除可以使FE还原为FE“，还可以与自由基成为较惰性物质，以中断自氧化连锁反应。提取液体积X与吸光度Y关系的回归方程为Y006013026433X尺099592体积ML图9提取液的还原力3结论31本实验采用正交试验方法，在提取2次情况下，确定当归中总黄酮最佳提取工艺为提取温度8O，乙醇浓度75，提取时间35H，料液比130。在此最佳条件下，总黄酮的提取量为94642MGG。方法精密度高，回收率好，平均加标回收率为9951，RSD为4O411,5，说明该方法适合于当归总黄酮的提取。32当归总黄酮的体外抗氧化性实验表明，当归总黄酮提取液有较好的清除自由基及抑制超氧阴离子自由基的作用，还有较好的还原作用，但抗氧化活性低于抗坏血酸。当归总黄酮浓度为0068MGML时，清除率可达到7402；浓度为0034MGM