抗生素发酵生产工艺

11.1概述11.2青霉素的发酵生产工艺11.3自学,第十一章抗生素发酵生产工艺,抗生素发酵生产工艺,概述,11.1概述,抗生素概念：由生物产生的（或化学合成获得的），能在低浓度下选择性抑制或杀灭其它微生物或肿瘤细胞的有机物质。抗生素的命名原则：根据来源抗生素的署名定名的抗生素根据化学结构和性质定名的抗生素一些习惯俗名、发现的地名等命名,抗生素发酵生产工艺,概述,产物的生物来源化学结构作用机理作用对象生产工艺应用领域,抗生素发酵生产工艺,概述,工业生产方法,抗生素发酵生产工艺,概述,1、微生物发酵法,（即生物合成法）：是利用特定的微生物，在一定的条件下（培养基、温度、pH、通气、搅拌等）使之生长繁殖，并在代谢过程中产生抗生素。然后选用适当理化手段将抗生素从发酵液中提取、精制，最后获得符合药典规定的各种抗生素成品。,抗生素发酵生产工艺,概述,抗生素发酵生产工艺,概述,1、生物合成法,传统方法；“工程菌”制造法；细胞融合技术法。,抗生素发酵生产工艺,概述,传统方法,传统方法目前存在很多不足，因此，人们采用基因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。,大多数抗生素是由放线菌产生的。菌种通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风搅拌发酵罐生产。,抗生素发酵生产工艺,概述,“工程菌”制造法,我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。新的“工程菌”生产的新抗生素毒副作用小，对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。,第一次由“工程菌”制造的全新抗生素麦迪紫红素A，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工程菌”产生了全新的抗生素。,抗生素发酵生产工艺,概述,细胞融合技术法,目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的新型抗生素问世。,对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提高140倍。,抗生素发酵生产工艺,概述,2、全化学合成法,（即化学合成法）：某些抗生素的化学结构已经明确且较简单时，可采用全化学的方法进行合成制取抗生素。,如：氯霉素、磷霉素等。,抗生素发酵生产工艺,概述,氯霉素分子结构图,抗生素发酵生产工艺,概述,全化学合成法的优缺点,优点,效率较高，受影响因素少，克服了发酵法生产的缺点。,抗生素发酵生产工艺,概述,缺点,导致严重的环境污染问题。,抗生素发酵生产工艺,概述,3、半化学合成法,即半合成法，将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法引入特定的功能基团,进行分子结构改造而获得的新抗生素品种或制成各种衍生物。,抗生素发酵生产工艺,概述,此种方法一般分两个阶段进行：,抗生素发酵生产工艺,概述,许多细菌逐渐出现了耐药性，已经证实某些耐药因子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结果耐药菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。,抗生素发酵生产工艺,概述,半合成抗生素的目的：,抗生素发酵生产工艺,概述,微生物合成抗生素,上游：菌种保存、选育、孢子及种子制备发酵适宜的培养基碳源氮源无机盐（微量元素）前体,下游：提取预处理过滤进一步提取,结晶干燥,纯品,成品:,制剂工作,抗生素发酵生产工艺,概述,11.1概述11.2青霉素的发酵生产工艺,第十一章抗生素发酵生产工艺,11.2青霉素的发酵生产工艺,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,青霉素是抗生素的一种，是从青霉菌培养液中提取的药物，是第一种能够治疗人类细菌感染疾病的抗生素。,青霉素是提纯产品的大规模用于临床的第一种抗生素，和原子弹、雷达被认为是第二次世界大战中最伟大的三项发明。,1青霉素发现,1929:Fleming在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。1939：病理家HowardFlorey、化学家ErnstChain,NormanHeatley。发酵瓶培养霉菌，培养物中提取，测活性，青霉素结晶。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,2、作用机理,细胞壁合成中的肽聚糖合成的第三阶段肽聚糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。生长中的细胞有效，静止细胞无效高效、安全的抗细菌感染药物。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3、应用,临床抗感染治疗：大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体等。毒性小，但需要皮试。各种半合成抗生素的原料：氨苄青霉素、磺苄青霉素、乙氧萘青霉素、头孢菌素母核。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,6-氨基青霉烷酸,菌种：Penicilliumchrosogenum生产能力达到30000-60000U/mL当今世界青霉素工业发酵水平已达85000U/mL以上青霉穗:分生孢子链状深层培养菌丝：球状和丝状两种。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,青霉素生产菌种一般在真空冷冻干燥状态下，保存其分生孢子。也可以用甘油或乳糖溶液作悬浮剂，在-70冰箱或液氮中保存孢子悬液或营养菌丝体。冷冻营养菌丝体进行保存可避免分生孢子传代时可能造成的变异。一般来说，分生孢子传代比菌丝传代更易发生变异。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,菌种保存,青霉素生产流程图,发酵工艺,冷至15,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,1、种子制备,种子制备阶段包括孢子培养和种子培养两个过程。孢子培养以产生丰富的孢子（斜面和孢子培养）为目的。种子培养以繁殖大量健壮的菌丝体（种子罐培养）为主要目的。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,孢子和菌丝的质量对青霉素产量有直接的影响，必须对其生产过程的每一环节严格控制。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,1）生产孢子制备工艺,产黄青霉孢子是将砂土孢子用甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的固体培养基进行斜面培养的。米孢子：转接到大米或小米固体培养基上，25生长7天注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,2）生产种子制备工艺,一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等；培养条件：通气量1:3（体积比）；300350rpm；pH自然，温度271,40h左右。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,2）生产种子制备工艺,一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10培养基：葡萄糖，玉米浆等。培养条件：1:11.5；250280rpm；pH自然，251。1014h后便可以作为发酵罐的种子。种子质量要求：菌丝致密，菌丝粗壮。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,2、生产罐培养工艺,三级罐：生产罐；接种量20培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3，玉米油，硅油。参数条件：通气比：1:0.71.8；150200r/min；前60小时：pH6.46.6，26；60小时后：pH6.7,24。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3、发酵培养与过程控制,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,分批发酵来说，发酵生产又分为菌体生长和产物合成两个阶段。进入生产阶段的必要条件是降低菌丝生长速度这可以通过限制糖的供给来实现。,3、发酵培养与过程控制,反复分批式发酵发酵罐：100M3，装料80M3带放:610次，带放量10，间隔24h。发酵周期：180220h,带放：是指发酵到一定时间后，放出一部分培养物。,补料：间歇或连续补加一种或多种成分培养基的操作过程,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.1过程控制补料分批操作控制基质浓度,前40小时：培养基中的主要营养物40小时后：低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸盐前体等，维持一定的最适浓度。半饥饿状态：延长合成期，提高产量。碳源占成本12以上，采用糖化液流加，降低成本。糖与6-APA结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。,前体：是加入到发酵培养基中的某些化合物，能被直接参与产物的生物合成，组成产物分子的一部分，而自身的结构没有发生多大的变化。,前体能明显提高产品的产量和质量，一定条件下还能控制菌体的合成方向。前体不仅具有毒性，而且能被菌体分解，因此，采取少量流加工艺。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,流加碳源控制,根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量间接调控。葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。残糖0.30.6左右，pH开始升高时流加糖。浓度：50kg/M3，流速:1.02.5kg/M3.h,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,流加氮源控制,玉米浆:最好，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素氨基氮浓度：0.010.05%。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,盐离子控制,无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁对青霉素合成有毒，3040ug/ml以下。罐壁涂环氧树脂保护层。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.2添加青霉素侧链前体,时期：合成阶段种类：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等可作为青霉素G的侧链前体毒性：前体对青霉菌的生长发育有毒性策略：低浓度流加浓度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.050.08%,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.3温度控制,适宜菌丝生长温度30，分泌青霉素20。20青霉素破坏少，但周期很长。变温控制，不同阶段不同温度，适合不同发酵阶段的需要。生长阶段：较高温度，缩短生长时间（56h）；生产阶段适当降低温度（180h），以利于青霉素合成。前期控制26左右，后期降温控制24。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.4pH控制,合成适宜pH6.46.6左右，碱性下易分解，避免超过7.0。直接加酸或碱：自动控制。pH较低时：补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量。pH较高时：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）。根据pH值来补糖：pH值上升快时多补，下降慢时少补；变速，依赖pH变化快慢，以维持适宜的pH。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.5溶氧在线控制,溶氧控制：3030饱和度，产率急剧下降适宜的搅拌速度：保证气液混合，提高溶氧溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的参考依据指标之一。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.6消沫,天然油脂：玉米油化学消沫剂：泡敌策略：少量多次注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂，水中溶解度很小青霉素盐很稳定，易溶于水；降解产物具有致敏性防止降解，条件温和、快速。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,1、预处理,改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步操作。,1.1预处理目的,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,1、预处理,加热法调节悬浮液的pH值凝聚和絮凝加入草酸、三聚磷酸钠（Na5P3O10）、黄血盐等可除去Ca2+，Mg2+，Fe2+等无机离子,1.2预处理方法,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,发酵液的过滤,板框过滤机,鼓式真空过滤机,1、预处理,青霉素的存在部位：发酵液浓度较低：1030Kg/M3含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程预处理：发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,2、过滤（发酵液的固液分离）,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。,常用的方法为过滤和离心分离等化工单元操作,2、过滤（发酵液的固液分离）,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,常见的固液分离方法离心沉降微孔膜过滤双水相萃取,影响过滤的因素菌种：真菌，放线菌，细菌培养基：黄豆，花生，淀粉，后期加油，培养基未用完发酵时间：菌丝自溶前放罐黏度（发酵液）,2、过滤,鼓式真空过滤机过滤：一次滤液：pH6.27.2，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量0.52.0%。板框式过滤机过滤：10%硫酸调节pH4.55.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液：澄清透明，用于提取（收率90）,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3、溶剂萃取,原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用：醋酸丁