心血管系统与消化系统蛋白质组学研究-v.ppt

心血管疾病蛋白质组学与消化系统疾病蛋白质组学研究进展,重庆医科大学附属第一医院分子肿瘤及表观遗传学实验室向廷秀xiangtx1,培养开展临床（疾病）蛋白组学研究的能力,目标:,常见心血管疾病蛋白质组学研究慢性心肌缺血中的自噬作用脂肪组织的蛋白质组学研究幽门螺旋杆菌的蛋白质组学研究肠道干细胞的蛋白质组学研究,主要内容,心血管疾病蛋白质组学,CardiovascularProteomics,心血管系统,心血管系统由心脏、血管和调节血液循环的神经体液装置所组成,其功能是通过血液将氧和营养物质供给组织,将组织代谢废物运出。,Thehumanheartbeatsover100,000timesandmoves,5,700litersofbloodeachdaythroughoutthelifetimeofanindividual.,心血管疾病,心脏和血管疾病（心血管疾病）是多种疾病的总称。包括动脉粥样硬化，冠状动脉粥样硬化症，冠状动脉硬化性心脏病，血栓阻塞部分心脏内的血液流动引起的心脏病发作，高血压病，风湿病，心力衰竭，心律失常，心脏瓣膜疾病，向大脑供血的血管发生阻塞引起的缺血性中风，大脑内的血管破裂引起的出血性中风等。,国家心血管病中心,2013年发布中国血管病报告2012年我国心血管病患病人数仍呈快速增长态势目前我国约有2.9亿人患冠心病、脑卒中、心力衰竭和高血压等心血管病死于心血管病每年约350万人（2012，300）每天约9590人（2012，8200）每时约400人（2012，340）每10秒1人,占死亡原因的41%，居各种死因之首,高血压2.66亿,脑卒中700万,心肌梗死200万,心力衰竭420万,肺心病500万,风心病250万,先心病200万,目前我国成人血脂异常2.5亿，患病率达18.6%50-75%脑卒中和40-50%心梗发生与血压升高有关,发病率和死亡率呈持续上升阶段,医疗费用366亿/年,每5个成年人中有1人患高血压18岁以上成人2012估计患病率24%,“EthicaAward”奖杯设立于2001年，以在1977年开展全球首例经皮冠状动脉介入治疗的“介入心脏病学之父”安德烈亚斯格林特茨格（AndreasGruentzig）教授的名义，每年在全球范围内选出一位对心血管介入事业做出杰出贡献的导师、科学家、临床医师和先驱者，表彰其终身成就。高润霖院士作为“中国心血管介入治疗的先驱者”，全球第13位获奖者，首位获此殊荣的中国专家。,烟草防控不力,超重/肥胖,心血管病发病和死亡率居高不下,膳食结构不合理,身体活动不足,血脂异常,中国心血管疾病发生数上升幅度将超过50%人口老龄化与人口增长将额外增长23%血压、胆固醇以及糖尿病增长超过25%的成年人超重或肥胖2030年，心血管病发生数将增加2130万心血管病死亡人数将增加770万,心血管病发病及死亡状况触目惊心,2005-2015年经济损失5500亿美元,“如果中国的心血管疾病、糖尿病等慢性病不加以控制，那么改革开放以后的几乎一半的经济成果都将可能被这些重大慢性病消耗殆尽。”,心血管疾病已经成为威胁中国未来发展的严峻问题,心脑血管疾病的住院费用急剧攀升2004年以来急性心肌梗死年均增长速度34.46脑出血26.85脑梗死31.05,世界卫生组织总干事陈冯富珍,提高对心血管疾病的诊断及治疗水平势在必行,对心血管疾病状态下细胞中蛋白质结构、功能和表达规律的研究，将有助于阐明疾病发生的细胞和分子机制，从而为心血管疾病的防治提供新的思路,人类基因测序完成在科学史上具有里程碑意义，但即便探究一个细胞完整的基因序列，也不能揭示其所有的生理、病理活动。因为基因生物学功能的执行者是蛋白质。蛋白质的修饰加工、转运定位、相互作用等并不能从mRNA水平预测,全面了解在生理和病理状态下，心血管系统的蛋白质谱变化，将获得对心血管系统疾病发病机制的更为深入的认识，并有可能找到某些生物学标志物,用蛋白质组学研究技术对心血管疾病进行研究,人类基因组共组成24个染色体，分别是22个体染色体、X染色体与Y染色体。含有约30亿个DNA碱基对。1990年10月，多个国家正式参与了人类基因组计划，该计划旨在阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。人类基因组计划与曼哈顿计划、阿波罗计划并称为世界三大科学计划。2001年8月26日，中国提前两年完成1%人类基因组测序任务。2003年4月15日，参与的六个国家共同宣布人类基因组序列图完成。,人类基因组计划humangenomeproject,HGP,翻译后蛋白质的修饰是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。许多蛋白质在翻译后会在不同的基团上发生不同的修饰，修饰后的蛋白质在生物体的功能调节上起关键作用。,对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。,心肌细胞和组织的蛋白质组学分析特别具有挑战性,心肌細胞是分化完全的細胞，再生能力很有限心脏在人体是独一无二的，供体只能在死亡的患者体内获取,心脏肩负着向全身供血的重要任务，是主宰生命的特殊器官。,人类蛋白质参考库（HPRD）具有很高的可靠性。目前数据库中所注释的蛋白质已超过2万个，有3万多条相互作用的蛋白质数据，还包括一些蛋白质功能域、蛋白质翻译后修饰等方面的信息。每个查询结果中都有相关的文献支持。此数据库是目前为止与人类基因、蛋白质相关的最全面的文本挖掘数据库。,其中有5079个已注明的心脏蛋白质67%的至少记载有一种翻译后蛋白修饰磷酸化占90%以上,HumanProteinReferenceDatabase(HPRD)(),establishedbyDrAkhileshPandey(JohnsHopkinsUniversity).,humanproteinreferencedatabase，http：/,2013年11月6日，复旦大学与美国加州大学经过3年多的合作，终于在心脏蛋白质组生物信息学研究方面取得重要进展，创建了全球首个统一标准的“心脏细胞器蛋白质图谱库”。这项研究犹如一座桥梁，把原来“分散进行”的心脏生物学基础研究和临床心脏医学研究两大领域连为一体，对促进心脏转化医学研究进程有重要意义。,磷酸化乙酰化甲基化糖基化羧基化羟基化核苷酸化脂酰基化泛素化碘基化。,蛋白翻译后修饰(Post-TranslationalModificationsPTMs),三大基本支撑技术：双向电泳技术质谱技术计算机图像分析与大规模数据处理技术,对相同关键词的搜索在不同的搜索器上可以有截然不同的结果,AnalysisofMSdataandassignmentofpeptide/proteinidentificationcanbedifficult,难确保系统能获得高准确度的质谱数据,因为蛋白的同源性，一种肽序列可以被分配到多个蛋白,新的技术不断出现同位素编码亲和标签技术、双色荧光技术定量蛋白质组学研究多重同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术是最新的定量蛋白质组学技术酵母双杂交技术、蛋白质复合物免疫分离与质谱鉴定技术-蛋白质-蛋白质相互作用多维色谱-质谱联用技术大规模蛋白质分离与鉴定磷酸化、糖基化蛋白质图谱展示与检测技术翻译后修饰蛋白质芯片技术,此前，获得绝对定量的蛋白质，我们被迫依靠ELISA或定量免疫印迹，两者都需要高品质的抗体。当有高品质的抗体，这些方法都是非常有价值的,随着最近通过多反应监测（MRM）,一种高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式,有可能没有抗体需要也能获得目标蛋白质的绝对定量,随着新技术的出现心血管蛋白质组学研究的文献也逐年增加,一、扩张型心肌病的蛋白质组学研究扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy，DCM)是一类病因不明的心肌疾病，其主要特征是心室扩张，室壁变薄，心肌收缩期泵功能障碍，产生充血性心力衰竭。在细胞水平可见心肌细胞肥大变性，间质纤维化等改变。迄今为止，DCM是利用蛋白质组学研究最为深入的一类心血管疾病。,细胞骨架肌纤维蛋白（肌球蛋白轻链-2）,线粒体能量产生相关蛋白（ATP合成酶肌酸激酶）,应激反应相关蛋白（HSP27),与心肌收缩功能障碍、心力衰竭的发生有一定关联,100种蛋白质表达异常，其中88种蛋白质丰度显著降低,JosephM.Corbett等以扩张型心肌病死亡患者心脏组织为研究对象,.,.,.,.,.,.,Content,Approach,Result,DCM患者活检标本,正常供体心肌,双向电泳(2-DE),MALDI质谱肽质量指纹图和测序分析,25种在DCM时发生显著变化;ATP合酶链;线粒体的肌酸激酶;Hsp27等,牛先天性DCM心肌,2-DE分析,35个相关蛋白质点，24种蛋白质表达下降，11种蛋白质丰度增高，包括线粒体和能量代谢表达的蛋白，,Knecht等采用2DE取得了3300个心肌蛋白条带，通过氨基酸序列分析，Edman降解法及基质辅助的激光解吸离子化质谱(MALDI-MS)等分析了其中150条，经活检及病理证实，有12条为扩张型心肌病特有的蛋白,DCMProteomics,二、心肌缺血、再灌注、损伤的蛋白质组学研究(ischemiareperfusioninjury，IR),心肌缺血是心脏常见的病理状态，影响心脏泵功能，导致心脑等重要器官供血不足，引发严重后果,包括从轻微缺血时的可逆性损伤到严重缺血时不可逆性细胞坏死。研究该过程中蛋白质组的变化，是理解这一病理过程的基础。,动物模型：牛猪犬大鼠,对PKC-转基因小鼠与未转基因小鼠进行研究,发现PKC-至少与93个蛋白形成复合物,PKC-相关的36种蛋白中有24种发生翻译后修饰，其中23种包含潜在的PKC磷酸化位点，说明PKC-介导的心肌保护作用与翻译后修饰相关,对该保护机制的研究多集中在对蛋白激酶C(PKC)功能蛋白质组学的探讨，多数认为PKC在心肌缺血预适应中起关键作用,PKC是心肌缺血保护中一种重要的信号激酶，它的激活启动了心肌细胞中一系列级联反应，阻抑细胞死亡,三、冠状动脉疾病的蛋白质组学研究,从健康受试者和冠状动脉疾病患者血液,高密度脂蛋白(HDL)血清蛋白之一可运载周围组织中的胆固醇进入肝脏促进其代谢维持组织中胆固醇量的相对恒定限制动脉粥样硬化的发生发展HDL作为动脉粥样硬化预防因子成为研究的重点,液相色谱-电喷雾离子化质谱仪分析(LC-ESI-MS/MS)基因本体技术(geneontology，GO)鉴定,研究对象,研究方法,HDL可结合48种特征性蛋白质13种蛋白是首次发现包括补体C4A/C4B，C9和补体调控蛋白vitronectin等,研究结果,四、心力衰竭的蛋白质组学研究(heartfailure),心力衰竭的临床表现有左心室泵血功能降低、射血分数下降、心脏扩大、神经体液反应活化，在细胞水平出现心肌细胞形态和收缩功能的变化，常是各种病因所致心脏病的终末阶段。,不同诱发因素造心衰模型电起搏诱发犬心衰内皮素-1(ET-1)诱导的向心性肥大白血病抑制因子（LIF）诱导的离心性肥大,临床将研究结果主要用于：,从蛋白质水平研究相关心血管疾病的发病机制；应用心血管疾病蛋白标记物来更早、更准确地检测心血管疾病，尤其是急性冠脉综合征(ACS)；蛋白质组学来源的信息作为目前患者诊断的补充；蛋白质组检测获得的信息有利于个体化治疗，为其提供新的治疗靶位；蛋白质组学检测工具和信息用于治疗的各个阶段，可以适时评估治疗的效果和校正治疗方案。,2-DEHeartProteinDatabasesAccessibleViaWWW,EmmaMcGregor,MichaelJ.Dunn.ProteomicsoftheHeart.CirculationResearch.2006;98:309,CardiovascularProteomics,应用蛋白质组学技术从整体上分析心血管系统的蛋白质组成成分的动态变化，了解蛋白质间的相互作用，将有助于阐明心血管疾病发病的分子机制和筛选特异的生物标志物。,PubDate:December2006,军事医学科学院、中科院上海生命科学研究院、复旦大学等在中国蛋白质组学领域最具实力的14个科研院所和个国家重点实验室等单位承担研究任务3500万元人民币的资助。,2002年我国启动人类重大疾病蛋白质组学研究项目,一项由我国名院士领衔、100多名中青年科学家参与的以肝炎、肝癌、心血管病等疾病为研究对象的高科技研究日前正式启动,建立了人和大鼠、狗等实验动物的心房、心室与内皮细胞的蛋白质2DE图谱的一系列数据库(http:/www.expasy.ch/ch2d/2dindex.html),鉴定了数百个心血管系统特有的蛋白质。,A2DEseparationof80gofheart(ventricle)proteins.,Thefirstdimensioncomprisedan18-cmnonlinear(NL)pH3to10IPGsubjectedtoisoelectricfocusing.Theseconddimensionwasa21-cm12%SDS-PAGEgel.Proteinsweredetectedbysilverstaining.TheNLpHrangeofthefirst-dimensionIPGstripisindicatedalongthetopofthegel,acidicpHtotheleft.TheMrscalecanbeusedtoestimatethemolecularweightsoftheseparatedproteins.,LCMofhumancardiactissue,A,Cardiacmyocytes.B,Bloodvessels.NLindicatesnonlinear.,IF:9.504,心脏线粒体和细胞质的分离和分析样品的制备2D-PAGE分析Western印迹MALDITOF质谱（MS）肽质量指纹PhosphopeptideEnrichmentandLiquidChromatography磷酸化肽的富集和液相色谱串联质谱,处理方法雄性Wistar大鼠（250-350克）一次性腹腔注射亚硝酸盐0,0.1,1.0,and10mg/kg体重,亚硝酸盐诱导心肌线粒体相关蛋白PDIA3,COQ9和ALDH2的改变,(Perlmanetal.CircRes.2009;104:796-804.),(Perlmanetal.CircRes.2009;104:796-804.),这些标志物的变化可用于调整临床处理方案,这些标志物可以指示出与治疗有关的亚细胞机制,这些标志物有助认识疾病的分子起源,提示调节表型的细胞治疗方向,生物标志物（Biomarkers）可以分为以下五类：前期指标（antecedentbiomarkers）：确定发生疾病的风险；筛选指标（screeningbiomarkers）：发现亚临床情况；诊断指标（diagnosticbiomarkers）：识别明显的疾病；分类指标（Classificationbiomarkers）：疾病的分类或程度；预后指标（prognosticbiomarkers）：预测疾病未来的进展，包括复发或对治疗的反应以及监测治疗的疗效。,临床前探索期，发现靶目标，确定生物标志物，明确可行性；临床验证期，生物标志物的检测方法标准化，得到公认并且与疾病相关；回顾性研究期，由临床流行病研究中心将库存的标本进行回顾性的研究；临床前瞻性研究期，通过纵向的前瞻性研究筛选疾病；临床应用期，通过在随机对照的临床研究或临床实践中的应用，达到控制疾病的目的。,生物标志物的确立是一个复杂的过程，一般需要经过五个阶段,一个新的生物标志物在应用前需要回答如下关键问题：,检测方法是否标准化？能否重复？准确性、有效性如何？生物标志物在一般人群或选择的健康人群中的分布情况？异常水平（参照标准和分辨值）？是否与已知的心血管危险因素相关？是否揭示新的发病机制？能否预测疾病的进程？解释新的生物标志物与心血管疾病的关系时哪些情况需要排除？新的标志物是否优于现有的标志物或增强其效益？新的标志物与已知的标志物联合，多重标志物检验能否使心血管疾病的诊断得以改善？是否增加预测危险能力？新的标志物能否反映药物的治疗疗效或相关的作用？新的标志物作为筛选、诊断、预后指标能否改善临床实践？价格效益比值如何？,本书英文版CardiovascularBiomarkers:PathophysiologyandDiseaseManagement由DavidA.Morrow博士组织国际顶级的心脏领域和实验室专家编撰，是心血管生物标志物方面的权威专著。Morrow博士是TIMI研究组中的重要成员，是国际公认的心脏缺血患者危险分层的顶级专家，是许多世界上有关心脏标志物应用指南及标准制定的重要参与者.,自噬(autophagy)是指细胞消化自身蛋白质或细胞内结构（细胞器）的一种自食过程。当细胞受外界压力时也会利用这过程维持自身生存。,自噬在心肌缺血-再灌注、扩张型心肌病、心力衰竭等疾病中普遍存在，在维持心肌细胞稳态，无论是结构还是功能方面都有重要作用。,慢性心肌缺血中的自噬作用,Autophagy-relatedpaper,Ryter,etal.ProcAmThoracSocVol7.pp4047,2010,自噬与凋亡,自噬-“自己吃自己”，是凋亡之外的第二种程序性细胞死亡方式。细胞的自噬被认为是参与绝大多数长半衰期蛋白质的降解。自噬一旦被过分激活，就会导致自噬性细胞死亡（AutophagicCellDeath），这是有别于凋亡的另一种程序性细胞死亡。,凋亡也称为型程序性细胞死亡，是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。细胞凋亡是机体清除多余、变异或恶化细胞的一种主动、程序化生理过程。该过程的正常与紊乱与机体进行新陈代谢、保持自身相对稳定以及肿瘤发生等密切相关。,自噬和凋亡属于程序性细胞死亡自噬通常有助于细胞存活，自噬过度激活会破坏过多的蛋白质和细胞器，导致细胞死亡，称为2型程序性细胞死亡而细胞凋亡却无一例外地最终导致细胞死亡,Progressionofcellapoptosis,visualisedwithAnnexinV-OregonGreen.,Apoptosis,凋亡细胞的典型形态学特点表现为：细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落，最后被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬；磷脂酰丝氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质DNA断裂。,LinY,etal.oncogene(2013),1-10,Chal-24inducesnon-apoptoticcelldeath,TRAIL(200ng/mlforA549)for8hwereusedasacontrolofapoptoticcelldeath,JNKandERKactivationisrequiredforChal-24-inducedcelldeath,自噬与自噬性细胞死亡,自噬(Autophagy)是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬是环境变化的适应性反应和细胞对代谢应激采取的措施自噬有处理废物的功能自噬抑制活性氧簇(ROS)的产生，具有细胞保护作用在细胞无法继续维持自身生存时自噬可诱导细胞主动性死亡.,哺乳动物细胞autophagy的三种主要方式：,根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞autophagy可分为三种主要方式：大自噬（Macroautophagy）：由内质网来源的膜包绕待降解物形成自噬体，然后与溶酶体融合并降解其内容物。小自噬（Microautophagy）：溶酶体的膜直接包裹长寿命蛋白等，并在溶酶体内降解。分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediatedautophagy，CMA)：胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消化。,Autophagy,amembranetraffickingprocessleadingtolysosomaldegradation,isimplicatedincancer,neurodegeneration,andaging.,在形态学上，即将发生自噬的细胞胞浆中出现大量游离的膜性结构，称为前自噬泡（自噬发生的铁证之一）。前自噬泡逐渐发展成为由双层膜结构形成的自噬泡（自噬发生的铁证之二），其中包裹着变性坏死的细胞器和部分细胞浆。自噬泡的外膜与溶酶体膜融合，内膜及其包裹的物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解。此过程使进入溶酶体中的物质分解为其组成成分，并被细胞再利用，这种吞噬了细胞内成分的溶酶体被称为自噬溶酶体。,自噬泡,Autolysosomes自噬溶酶体,细胞的自噬过程,Ryter,etal.ProcAmThoracSocVol7.pp4047,2010,自噬泡(phagophore)或自噬体(autophagosome)形成方面的稳态监测方法和细胞自噬的过程(Flux)监测。检测自噬的金指标：透射电镜检测。自噬体膜标志性蛋白质的检测：利用WesternBlot检测LC3-III比值的变化以评价自噬形成或在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成。研究Beclin1(哺乳动物自噬的标记蛋白，参与自噬体膜的形成)单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。对自噬溶酶体及其残体的检测有吖啶橙染色法；残体的检测主要是对脂褐素颗粒的显微观察。,自噬体的研究和检测方法,电镜,Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagicvacuole，AV）,无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。,荧光显微镜下：采用GFP-LC3融合蛋白示踪自噬形成,WesternBlot检测LC3-II/I比值的变化,正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，可对自噬进行人工干预和调节。（一）自噬诱导剂1）BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin：模拟内质网应激2）Carbamazepine/L-690，330/LithiumChloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶）3）Earles平衡盐溶液：制造饥饿4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：ClassIPI3KPathway抑制剂5）Rapamycin：mTOR抑制剂6）XestosponginB/C：IP3R阻滞剂（二）自噬抑制剂1）3-Methyladenine（3-MA）：（ClassIIIPI3K）hVps34抑制剂2）BafilomycinA1：质子泵抑制剂3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomallumenalkalizer（溶酶体腔碱化剂）,Autophagyinchronicallyischemicmyocardium,1、动物模型的制作2、自噬形态学的电镜观察3、蛋白的提取4、双相电泳分离5、MALDITOFMS分析6、数据库搜索7、差异表达蛋白的WB验证与定位研究,动物模型的制作,Chronicallyinstrumentedpigswerestudiedwithrepetitivemyocardialischemiaproducedbyone,three,orsixepisodesof90minofcoronarystenosis(冠状动脉狭窄)30%reductioninbaselinecoronaryflowfollowedbyreperfusion(再灌注)every12hwiththenon-ISregionascontrol.Inthismodel,wallthickeningintheISregionwaschronicallydepressedby37%.,ElectronmicrographsofdifferenttypesofAVsobservedinthesix-episodechronicallyISregion(AC)andsix-episodeNIregion(D).,(A)Autophagicvacuoles(Avs,自体吞噬泡)containingremnantsofmitochondriaaredemonstrated.(B)DoublemembraneAVscontainingrecognizablecytoplasmiccontentsaredisplayed.(C)AVscontainingmultivesicularbodiessurroundedbyasequesteringmembranearedemonstrated.(D)TheseAVswerenotobservedinthesix-episodeNI.ArrowsindicateAVs.(Magnifications:1,4002,000,AD;5,000,AandBInsets.),AlterationofcathepsinDinchronicallyISmyocardium.,(Upper)2DgelmapofproteinextractsfromchronicallyISregionaftersixepisodes.(Lower)AmagnifiedgelregionfromtheNIregion(Left)andtheISaftereitherthree(Center)orsix(Right)episodesofCS.ArrowsindicatethespotsaftersixepisodesthatwerealllateridentifiedascathepsinD.MW,molecularweight.Eachlowerimageisa6-foldmagnificationfromtheoriginalgel.,ComparisonofexpressionlevelofcathepsinBandDinchronicallyISmyocardiumatdifferentepisodes,ComparisonofexpressionlevelofcathepsinBandDinchronicallyISmyocardiumatdifferentepisodes.(AandB)WesternblotanalysisofcathepsinD(A)andcathepsinB(B)atsixepisodeschronicallyISvs.NIregions(Upper)andthreeepisodes(Lower).TheexpressionofcathepsinsBandDsignificantlyincreasedatsixepisodes(*,P0.01;*,P0.05vs.NI).(C)ThedirectcomparisonoflevelsofcathepsinB(CB)andcathepsinD(CD)inchronicallyISinone,three,andsixepisodes,againshowingmarkedincreasedexpressionofbothproteinsaftersixepisodes.(D)TheelevatedexpressionofcathepsinsBandDwasconfirmedtooccurinmyocytesfromthechronicallyISmyocardium.ADU,arbitrarydensitometricunits.,EnzymeactivityassaysofcathepsinB(A),cathepsinD(B),and-hexosaminidase(C),EnzymeactivityassaysofcathepsinB(A),cathepsinD(B),and-hexosaminidase(C).ActivityofbothcathepsinBandDand-hexosaminidasewasmuchhigheratsixepisodesinchronicallyISregionvs.NIregioncomparedwiththreeepisodesvs.NI.*,P0.01vs.NI;*,P0.05vsNI.,WesternblotanalysisofHsc73atsixepisodeschronicallyISvs.NI(non-IS)myocardium(A)andatthreeepisodesinisolatedmyocytes(B)andcomparingeffectsinnecrotictissueaftermyocardialinfarction(IF)vs.NIregions(C).,TheexpressionofHsc73increasedsignificantlyinthechronicallyISofsixepisodes(*,P0.01vs.NI),butnotintheISafterthreeepisodescomparedwithNI.TheelevationofHsc73aftersixepisodeswasconfirmedinisolatedmyocytes.Incontrast,theexpressionofHsc73decreasedintheinfarctedregion.ADU,arbitrarydensitometricunits.,Westernblotanalysisofbeclin1atthreeandsixepisodes(chronicallyISvs.NIregions),Westernblotanalysisofbeclin1atthreeandsixepisodes(chronicallyISvs.NIregions)(A)andinisolatedmyocytesfromthechronicallyIS(B)andcomparingeffectsinnecrotictissueaftermyocardialinfarction(IF)vs.NIregions(C).Theexpressionofbeclin1wasincreasedsignificantlyinthechronicallyISaftersixepisodes(*,P0.05vs.NI),butnotafterthreeepisodes.Theelevationofbeclin1aftersixepisodeswasconfirmedinisolatedmyocytes.Incontrast,theexpressionofbeclin1decreasedintheinfarctedregion.ADU,arbitrarydensitometricunits.,WesternblotanalysisofLC3atsixepisodeschronicallyISvs.NImyocardium.,WesternblotanalysisofLC3atsixepisodeschronicallyISvs.NImyocardium.TheLC3-II/LC3-IratiowassignificantlyincreasedinthechronicallyIS(*,P0.01vs.NI).Westernblottingofactinshowedequalloadingofthesamples.,LocalizationofcathepsinBandduallabelingofcathepsinBandapoptosis,LocalizationofcathepsinBandduallabelingofcathepsinBandapoptosis.(A)FluorescentimmunostainingfordetectionofcathepsinBinmyocytesaftersixepisodes.CathepsinB(green)waslocalizedtomyocytes.(BandC)Duallabelingofapoptosis(TUNEL)andcathepsinB.(B)StainingforcathepsinB(blue)wasmoreintenseinareaswhereapoptosiswasabsent.(C)Conversely,myocytesassociatedwithincreasedapoptosis(green)exhibitedmuchlesscathepsinB(indicatedbyblueandthearrow)immunostaining.(Magnification:430,A;275,BandC.),结论,证实了一种调节自噬过程的蛋白质-组织蛋白酶D的表达增加还发现组织蛋白酶B、热休克同源蛋白Hsc73(一种分子伴侣介导自噬的关键标志蛋白)、哺乳动物自噬基因beclin1、微管相关蛋白1轻链3(一种自噬泡标志物)的表达增加组织蛋白酶D的免疫组化染色结果显示,没有发现明显的凋亡,说明由缺血所触发的自噬是适应性机能,它可以抑制凋亡,减少慢性缺血所带来的有害影响.,缺血阶段通过AMPK-eEF2KmTOR通路引发自噬，而再灌注阶段却是通过ClassIIIPI3KBeclin1途径,脂肪组织的蛋白质组学研究,近年来，随着脂肪组织内分泌功能的发现，以蛋白质组学的技术和策略对其开展研究成为人们十分关注的一个领域。,根据分布、形态和功能的不同，可分为棕色脂肪组织，白色脂肪组织。,棕色脂肪组织(brownadiposetissue):细胞内含有大量的细胞色素C和线粒体而呈棕色；细胞间含有丰富的毛细血管和大量的交感神经纤维末梢，组成了一个完整的产热系统。含量：仅占正常人体重的1%（不同体重成人含量为肥胖人正常人瘦人）。分布：有限，仅见于颈、肩、腋窝、肩胛区部位及皮下、甲状腺、肾门、自主神经、嗜铬细胞。形态：呈多边形，直径约60m，内含多个小脂滴。,棕色脂肪组织是近年才被人们发现的一种脂肪组织，是哺乳动物体内非颤栗产热的主要来源,脂肪组织内分泌的新器官,近年来发现，脂肪组织(脂肪细胞、前脂肪细胞和巨噬细胞)还是一种代谢十分活跃、功能非常复杂的内分泌和旁分泌器官，分泌许多细胞因子和生物活性因子。在2005年第65届美国糖尿病学会（ADA）年会上，脂肪组织源性因子的研究成为一个亮点，PhillipEScherer博士在会上作了题为“脂肪组织：从脂肪储存库到内分泌器官”的精彩报告。脂肪组织作为一个内分泌器官已成为学术界的共识，脂肪内分泌学已成为内分泌学的一个新的领域。,“脂肪组织：从脂肪储存库到内分泌器官”的报告要点,脂肪组织及其分泌的脂联素(adiponectin)在胰岛素抵抗、心血管疾病、代谢综合征等发病机制中的重要作用，并以最新建立的转基因小鼠模型对脂肪组织的功能作进一步探讨。脂联素是脂肪细胞中表达最为丰富的激素，在血浆中有相当高的浓度，女性高于男性。脂联素在肥胖、2型糖尿病、心血管疾病和代谢综合征的发病机制中起重要作用，且脂联素研究也涉及伤口愈合、癌症等。脂联素的发现为胰岛素抵抗发病机制的研究开辟了另一条途径，理解脂联素的表达调控和作用机制至关重要。由于脂联素水平与胰岛素敏感性成正比，脂联素将来有可能成为如口服葡萄糖耐量试验一样的诊断工具，成为糖尿病的临床诊断标志物，也应用于心血管疾病和代谢综合征。,脂肪组织能分泌脂肪细胞因子和激素,脂肪组织分泌多种细胞因子和生物活性物质（如激素），统称为脂肪因子（adipokines）或脂肪细胞因子（adipocytokines）。它们不仅调控体内能量平衡，而且参与炎症、凝血、纤溶、胰岛素抵抗、糖尿病和动脉粥样硬化，甚至一些癌症的发生。,LagoFetal.(2007)Adipokinesasemergingmediatorsofimmuneresponseandinflammation.NatClinPractRheumatol3:716724,Themultiplefunctionsofwhiteadiposetissueincludethesynthesisandsecretionofadipokines,andtheuptake(摄取),storageandsynthesisoflipids,目前已知脂肪组织分泌的激素及活性物质有：,瘦素(leptin，LEP)脂联素(adiponectin，APN)抵抗素(resistin)内脏脂肪素（visfatin）孤儿G蛋白偶联受体APJ的天然配体(apelin)内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)网膜素(omentin),肝脏分泌的杀菌蛋白Hepcidin,hepaticbactericidalprotein,Hepc,又称肝脏表达的抗微生物肽(liverexpressedantimicrobialpeptide,LEAP-1)性激素血管紧张素前列腺素E2及前列腺素I2。,细胞因子,肿瘤坏死因子(TNF-)纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）白介素6和白介素8胰岛素样生长因子1（IGF-1）胰岛素样生长因子结合蛋白3,视黄醇结合蛋白（RBP）酰化刺激蛋白（ASP）补体D固醇脂转化蛋白磷酰化转化蛋白血管内皮生长因子等。新的细胞因子还在不断地被发现。,脂肪组织细胞因子脂联素瘦素抵抗素,巨噬细胞源性因子抵抗素（人）IL-1,促炎细胞因子与趋化因子TNFIL-6CCL2,巨噬细胞,脂肪细胞,凋亡的脂肪细胞,Tilg,H.,andA.R.Moschen.2006.Adipocytokines:mediatorslinkingadiposetissue,inflammationandimmunity.Nat.Rev.Immunol.6:772783.,脂联素(adiponectin)是一种重要的脂肪细胞因子家族成员,Adiponectin在血中有较高的浓度(530g/ml),几乎占血浆总蛋白的0.01。肥胖者其血浆水平却降低,在糖尿病、冠状动脉疾病患者其水平也低于正常。Adiponectin与胰岛素抵抗有密切联系,并可能有抗动脉粥样硬化的作用。,PhilippE.Scherer.AdiposeTissue,FromLipidStorageCompartmenttoEndocrineOrganDiabetes55:1537-1545,2006,瘦素(leptin):AKeyPlayerInWeightRegulation,脂肪细胞通过分泌瘦素来协调身体的能量供给和能量储存，使身体的脂肪总量保持相对稳定。瘦素通过对下丘脑起作用而影响与性发育相关的内分泌激素，使促性腺激素升高，启动青春发育，促使卵巢成熟、排卵，怀孕或睾丸发育成熟。瘦素的这些作用可以解释那些特别瘦的芭蕾舞女演员和女性职业运动员往往会停经，肥胖者会出现月经紊乱、生殖功能下降等现象。此外，肥胖的男性儿童，由于瘦素抵抗而造成性激素分泌紊乱、青春期延迟。瘦素还有抑制胰岛素产生、改善咦岛素敏感性的作用。由于肥胖者出现瘦素抵抗现象，抑制胰岛素产生的作用减弱，导致胰岛素分泌增多，形成高胰岛素血症，胰岛素的敏感性下降，从而促发糖尿病。,对于维持脂肪组织的生理功能而言,脂肪基质细胞与脂肪细胞间的反应是必需的。它们之间“交叉对话”的反常与导致胰岛素抵抗、2型糖尿病的重要发病机制有关,脂肪组织分泌蛋白质组的研究更有助于了解能量代谢和与之相关的疾病过程,并可能导致发现与能量代谢调节有关的未知蛋白质和肽,脂肪组织培养收集不同时间点的培养液提取蛋白质,Molecular与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃粘膜相关性淋巴样组织（MALT）淋巴瘤等疾病密切相关;世界卫生组织(WHO)已将其列为一类致癌因子；Marshall与Warren因对幽门螺杆菌的开创性研究而获得2005年度诺贝尔生理学/医学奖。,幽门螺杆菌helicobacterpylori,Hp,1982，Warren和Marshall分离出“unidentifiedcurvedbacilli”1984，Langenbergetal命名为“campylobacter-likeorganism,CLO”1988，Thompsonetal发现其16srRNA序列分析相似于“Wolinella属”,1989，Goodwinetal发现5个分类学特征，命名为“Hp”。1997，Tombetal完成了Hp26695菌株的基因组测序工作。1999，Almetal完成了HpJ99菌株的基因组测序工作。,幽门螺杆菌,特征:G(-)杆菌，S形，长2.5-4m，宽0.5-1.0m，2-6条鞭毛，微需氧菌，37,pH7.07.2幽门螺杆菌能在强酸环境中存活生长，而且能在胃黏膜深层繁殖流行病学：粪-口，或口-口传播。自然人群中的感染率随年龄增长而上升HP感染自愈率接近零,在各种胃病中的检出率,慢性胃炎53%95%胃溃疡病60%100%，平均84%十二指肠溃疡90%100%，平均95%胃癌43%78%胃淋巴瘤（尤其是MALT）90%以上,致病机理,定植(colonization)于胃粘膜上皮表面和胃粘液的底层损害胃粘膜屏障：H反向弥散细胞毒素：空泡毒素(Vac)A、空泡形成相关蛋白(Cag)A尿素酶：氨降低粘蛋白含量，毒性作用炎症反应：直接刺激免疫细胞，直接刺激胃粘膜上皮产生细胞因子。胃泌素关联假说：增加胃泌素释放，使胃酸分泌和胃蛋白酶活性增加。,Helicobacterpylorithebacteriumcausingpepticulcerdisease,幽门螺旋杆菌感染胃窦,十二指肠,胃窦,幽门,胃体,胃黏膜,炎性细胞,胃壁保护粘液,溃疡,胃炎可能导致十二指肠或胃溃疡，引起胃出血、胃穿孔等严重的并发症。,目前有关Hp的研究方向,遗传变异的研究毒力因子的确定免疫靶点和诊断靶点的筛选生理学研究耐药机制及细菌分型有关Hp的功能蛋白质组研究,Hp基因组及蛋白质组信息的部分相关网站,http:/www.ncbi.nl