western-blot原理及操作方法PPT课件

.,1,Westernblot,.,2,原理分类主要试剂操作步骤常见问题,.,3,原理,WesternBlot（蛋白免疫印迹）采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。,.,4,分类,SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）native-PAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶）区别在于加不加变性剂（比如SDS）使蛋白质变性，SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量,.,5,主要试剂,1.ddH2O2.30%丙烯酰胺混合液丙烯酰胺(arc)29g和N，N-亚甲双丙烯酰胺(bis)1g加H2O至100ml。储于棕色瓶，4避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否。,.,6,主要试剂,3.配胶缓冲液系统分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCL(pH8.8)；浓缩胶缓冲液：1.0mol/LTris-HCL(pH6.8)；电泳缓冲液：5XTris甘氨酸缓冲系统，4保存5电泳缓冲液（贮存液）的配制：0.125MTris15.1g1.25MGlycine94g0.5%SDS5g三蒸水定容至1000mL,.,7,主要试剂,在SDSPAGE不连续电泳中，浓缩胶其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。,.,8,主要试剂,4.10%十二烷基硫酸钠SDS溶液是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂去蛋白质电荷；断裂分子内和分子间的氢键，取消蛋白分子内的疏水作用；使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构，常温保存。,.,9,主要试剂,5.10%过硫酸铵（AP）催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺，4保存，一周内使用0.1g过硫酸铵溶于1mlddH2O中,.,10,主要试剂,6.四甲基乙二胺TEMED催凝剂，加速AP催化作用，在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构,.,11,主要试剂,7.8SDS-PAGELoadingBuffer溶液（上样缓冲液）loadingbuffer的功能主要有两个：第一，里边的指示剂溴酚蓝起到指示的作用，它是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使其沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液，加loading100加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。,.,12,主要试剂,8.10转印Buffer（贮存液）4保存10转印Buffer（贮存液）的配制：0.25MTris30.28g1.92MGlycine144.13g三蒸水定容至1000mL1TransferBuffer（工作液）：10TransferBuffer100mL三蒸水700mL20%甲醇200mL,.,13,主要试剂,9.甲醇转膜液中主要是降低电导的作用，防止转膜溶液过热。10.聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。,.,14,主要试剂,11.三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液Trisbuffersaline（1TBS）洗去Tween,因为Tween会影响发光10mMTris-HCl（pH=8.0）1M10mL150mMNaCl5M30mL三蒸水定容至1000mL12.TrisbuffersalineTween（TBST）缓冲液洗去未结合的抗体1TBS1000mL0.05%Tween-200.5mL,.,15,主要试剂,13.封闭缓冲液封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，防止一抗、二抗的非特异性反应TBSTBuffer100mL5%NonfatMilk5g14.一抗15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根过氧化酶）使试剂中的发光物氧化并发光16.ECL检测试剂,.,16,操作步骤,.,17,操作步骤,1.细胞总蛋白提取及定量2.配胶3.制胶先用1ml枪头小心铺12%分离胶，上加少许ddH2O，待分离胶干凝后，倒去ddH2O，用滤纸吸干。再铺8%浓缩胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶干后备用，拔去梳子。4.上样所有上样孔均加样，没有样本，用上样缓冲液代替。5.电泳取40g蛋白经8%浓缩胶电泳80V30min，12%分离胶电泳110V90min。6.转膜电泳结束后，切除浓缩胶，按照负极-3张滤纸-分离胶-PVDF滤膜-3张滤纸-正极的顺序，组装电转膜体系，100V转膜25min。,.,18,操作步骤,7.PVDF膜的免疫学检测PVDF膜经5%脱脂奶室温封闭1h一抗4温和震荡过夜TBST洗涤三次HRP标记二抗室温温育1hTBST洗涤三次后，应用化学发光底物检测试剂盒进行检测8.结果分析以GAPDH为内参照，以靶蛋白/内参照灰度的比值作为蛋白的相对表达含量，进行半定量检测,.,19,常见问题,1.分离胶浓度根据目的蛋白分子量选择胶的浓度蛋白分子量(kDa)凝胶浓度(%)4-402012-451510-7012.515-1001025-2008,.,20,常见问题,2.在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性,这是为了控制慢离子的解离度,从而控制其有效迁移率.要求在样品胶和浓缩胶中,慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低,以使样品夹在快、慢离子界面之间,使样品浓缩.而在分离胶中慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高,使样品不再受离子界面的影响.,.,21,常见问题,3.加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。也可以覆盖一层无水乙醇。,.,22,常见问题,4.从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。5.膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路6.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温7.切滤纸和膜时，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜,.,23,常见问题,8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体，而且二抗要标记有同位素或酶。9.条带两边扩散：加样量过多10.条带两