PCR技术原理与操作

PCR技术原理与操作,主要内容,核酸的种类与功能DNA复制原理PCR发展简史PCR基本原理PCR体系各组分及作用PCR操作步骤及分析PCR技术的优缺点,脱氧核糖核酸,核糖核酸,核酸,核酸是细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中起着极其重要的作用。,、种类,、功能,简称DNA,简称RNA,一核酸的种类与功能,3、微生物分类（按核酸类型）,（1）DNA微生物：细菌、寄生虫类（附红细胞体、弓形体）、衣原体、支原体DNA病毒疱疹病毒科:伪狂犬病毒、马立克病毒、传染性喉气管炎病毒和鸭瘟病毒；圆环病毒科：猪圆环病毒、鸡传染性贫血病毒；细小病毒科:猪细小病毒、犬细小病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒；痘病毒科：鸡痘、山羊痘和绵羊痘；腺病毒科：减蛋综合征病毒和犬传染性肝炎病毒,（2）RNA微生物,RNA病毒正粘病毒科：流感病毒副粘病毒科：新城疫病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒弹状病毒科：狂犬病病毒、牛流行热病毒冠状病毒科：鸡传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、SARSV黄病毒科：猪瘟、乙型脑炎病毒、牛病毒性腹泻病毒小核糖核酸病毒科：口蹄疫病毒披膜病毒科：猪繁殖与呼吸综合征病毒双RNA病毒：传染性法氏囊病毒反转录病毒：禽白血病、牛白血病、马传染性贫血病毒,二DNA复制原理,半保留复制,三PCR发展简史,KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法.,三PCR发展简史,Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，,三PCR发展简史,四PCR基本原理,类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,模板DNA,PCR原理,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,四PCR基本原理,1、PCR体系组分,引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）,五PCR体系各组分及作用,（1）模板模板作为DNA合成时的初始链，可以是DNA或cDNA分子，模板需要量一般为102105拷贝。（2）扩增缓冲液缓冲液有助于酶的稳定，是给聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件。1050mmol/LTris-Hcl(pH8.38.8）（3）耐热DNA聚合酶催化PCR反应，该酶是从Thermusaquaticus细菌中提取的特殊的耐热DNA聚合酶，可以耐受90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本；具有53方向的聚合活性和外切活性。,2、各要素作用,五PCR体系各组分及作用,美国Yellowstone公园的热泉,嗜热水生细菌Thermusaquaticus,1988年saiki从嗜热水生菌ThermusaquaticsYT-1株中直接分离出来。该菌株于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离到。,（4）4种dNTP混合物四种脱氧核苷酸，是DNA的原料；dNTP的通常使用浓度为20200mol/L。（5）引物作为合成起始的识别点，从引物末端开始延伸，合成整条链。通常使用浓度为0.1-0.5mol/L（6）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被DNA聚合酶识别；通常使用浓度为0.5mmol/L-2.5mmol/L。,五PCR体系各组分及作用,六PCR操作步骤与结果分析,1、RNA/DNA提取2、RNA的反转录3、PCR扩增4、电泳分析产物,1、RNA/DNA提取,（1）异硫氰酸胍法和Trizol提取法（RNA)（2）酚-氯仿提取法和DNAzol提取法（DNA)（3）柱子提取法（4）全自动核酸提取法,（1）Trizol提取RNA法：,取1.5mL灭菌Eppendorf管，每管加入300L裂解液，然后分别加入待测样品、阴阳性对照各100L，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）室温放置2-5min；再加入100L氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于4条件下，12000r/min离心15min。Trizol使细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。加入氯仿，有变性蛋白质的作用，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层。吸取离心后各管中的上清液150L转移至新的1.5mL灭菌Eppendorf管中（注意不要吸出中间层，要缓慢出），加入150L20预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀核酸。,（1）Trizol提取RNA法：,4条件下12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应置于吸水纸不同地方沾干。加入1mL75%乙醇，轻轻颠倒洗涤。4条件下12000r/min离心5min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白。,(1)Trizol提取RNA法：,4条件下12000r/min离心30s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头（注意：滴头勿接触沉淀），真空抽干3-5min或室温干燥10min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。加入11LDEPC水，轻轻吹打混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于70冰箱备用。,注意事项,RNA提取时，要戴口罩、手套，所用EP管、滴头及相关容器等要清洁，用0.1%DEPC水处理12h以上再经高压处理,烘干后方可使用。要有专用操作台（在超净工作台或生物安全柜进行操作）。所有试剂应在规定的温度储存，使用后立即放回。异丙醇和75%乙醇要放在20预冷。加样和混匀时一份样品要换用一个吸头，不同样品加同一试剂时吸头要悬空加入，避免交叉污染。加入Trizol试剂后要作用一定时间（5min），使其充分裂解释放RNA。吸取水相RNA时，要避免吸到中间液面（蛋白质层），从而保证RNA纯度。要小心、细致、晃动及每次移液要轻。这样做的目的：一是小心RNase的污染降解RNA；二是动作过大会破坏RNA的完整性。要勤换手套，操作过程速度要快。,(2)DNA提取,样品采集：取病死或扑杀的动物组织；活体动物可取血清、咽喉或鼻腔拭子。样品处理：每份样品分别处理组织样品处理：称取待检病料0.2g置组织研磨器中剪碎并研磨，加入600L裂解液继续研磨。取已研磨好的待检病料离心后取上清100L加入1.5mL灭菌离心管中，再加入500L裂解液和10L蛋白酶K，混匀后，置55水浴中30min1h。全血样品/咽喉或鼻腔拭子的处理：血凝后，8000rpm离心5min，取血清100L；咽喉或鼻腔拭子向其中加入300500L的PBS混悬液，10000rpm离心5min，取上清100L；加入500L裂解液和10L蛋白酶K，混匀后，置55水浴中30min1h。裂解液使组织变性，释放DNA。蛋白酶K主要降解组织中的天然蛋白。,(2)DNA提取,样品DNA的抽提自水浴锅中取出已处理的样品，加500L酚-氯仿-异戊醇(用之前不要晃动，不要吸到上层保护液)，颠倒混匀，12000rpm离心10min。酚-氯仿-异戊醇，使DNA从组织中游离到水相，与蛋白分开。取约500L上清置于灭菌离心管中，加入500L异丙醇，混匀，室温沉淀10-20min。异丙醇主要沉淀DNA。取出样品管，13000rpm离心15min。弃上清，加入700L70%乙醇，轻弹管壁以使沉淀充分悬浮，12000rpm离心5min，弃上清，将离心管倒扣于吸水纸上1min以吸干残液或10000rpm空离30sec后用移液器吸去残液（注意：滴头勿接触沉淀），再将离心管50烘干或真空抽干15min(以无乙醇味为准)。乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白。取出样品管，用10-20L灭菌的去离子水溶解沉淀，作为模板DNA备用。,32,全自动提取核酸,实现自动化,提高了RNA提取效率和纯度，适合高通量检测（32份样品，时间35min）。,全自动核酸提取仪,(3)RNA的反转录,cDNA的合成：取RNA10L加入反转录反应体系中，37水浴1h后，直接用于下面的PCR反应或-20冻存备用。,(4)PCR扩增,取RNA反转录产物或提取的DNA（DNA直接进行扩增）2L加入PCR反应体系中，总体系25L。扩增条件为955min后，9445sec，5645sec，7245sec共35个循环，最后72延伸10min。,取TAE缓冲液50倍稀释后用于配制1.5的琼脂糖凝胶及作电泳缓冲液用。取10LPCR产物，混于2L6上样缓冲液液中，电泳分析PCR产物。以DNA分子