基因工程的基本概念yu

云南大学2015春季必修课程,基 因 工 程,云南大学 余敏,Email ,生命科学与生物技术的理论体系,研究对象,研究层次,量子,分子,细胞,组织,个体,群体,细菌,真菌,病毒,植物,动物,人类,遗传,生理,生物,生态,仿生,分子生物学,细胞生物学,化学工程,生命科学,生物工程,生物技术,研究内容,生命科学理论与技术,3,4,1,细胞生物学基础,分子免疫学基础,生物技术与生物工程,2,分子生物学基础,细胞生物学基础,A 细胞的结构与功能,B 细胞的分裂与增殖,C 细胞的衰老与凋亡,D 细胞的生长与分化,E 细胞的物质运输,F 细胞的信号传递,分子生物学基础,分子生物学的三大基本内容：,生物大分子的结构与功能（结构分子生物学）,基因的表达和调控机制（中心法则）,分子生物学实验技术（实验分子生物学）,遗传信息传递的中心法则,DNA（基因）,DNA（基因）,mRNA,蛋白质,生物代谢物质,复制,转录,翻译,代谢,基因组学,转录组学,蛋白组学,代谢组学,逆转录,生物大分子的结构与功能,DNA（基因）,蛋白质,多糖,指导合成关系,核酸,脂类,相互作用关系,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程的基本概念,基因工程的基本原理,基因工程所需的基本条件,基因工程的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,大肠杆菌基因工程,酵母基因工程,哺乳动物基因工程,高等植物基因工程,D 基因工程的基本形式,1 基因工程的基本概念,C 重组DNA技术与基因工程的基本用途,B 基因工程的基本定义,A 重组DNA技术的基本定义,E 基因工程的发展,A 重组DNA技术的基本定义,1 基因工程的基本概念,重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,B 基因工程的基本定义,1 基因工程的基本概念,基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,C 重组DNA技术与基因工程的基本用途,1 基因工程的基本概念,分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源,大规模生产生物活性物质,设计、构建生物的新性状甚至新物种,大规模生产生物活性物质,工程细胞,基因工程蛋白质工程途径工程,发酵工程细胞工程,分离工程,酶,酶工程,分离工程,天然细胞,天然细胞,生物活性物质,有多个术语表述基因工程：基因工程（gene engineering）;遗传工程（genetic engineering）;基因操作（gene manipulation）;重组DNA技术（recombinant DNA technique）;基因克隆（gene clone）;分子克隆（molecular clone）等等。现在人们的基因工程，主要是强调通过基因操作，改变生物的性状，获得人类需要的某些产品或生物性状。,D 基因工程的基本形式,1 基因工程的基本概念,第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程,第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程,第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程,第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程,现代生物工程技术,1 基因工程的基本概念,基因工程在现代生物工程技术中的地位,蛋白质工程的概念,在利用基因工程技术了解编码蛋白质的基因的基础上，对蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行分析;进而通过对蛋白质的结构、氨基酸序列的改造和翻译后的修饰等手段，改变甚至创造出新的和更有效的蛋白质。,蛋白质工程主要内容,主要目标 蛋白质氨基酸序列的分析 蛋白质晶体结构分析 蛋白质功能预测和分析 蛋白质组分析,细胞（组织）工程概念,组织工程：利用移植的细胞、骨架、DNA、蛋白质或蛋白质片段替代或修复已受伤或损坏的组织和器官生物加工工程： 利用活细胞生产生物医药产品,组织工程人造器官,王正敏,干细胞：1999年4月， 美国的科研人员首次成功地从成年人骨髓的干细胞在体外培养分化出软骨、脂肪和骨骼细胞。标志着干细胞的研究取得了重大进展。以这项技术为代表的组织工程的突破具有广阔的应用前景，在不远的将来为实现人造“器官”成为可能。,酶工程的概念,是酶学与工程学的相互渗透和结合所发展起来，以酶为研究对象，改造并应用酶的特异催化功能。目标就是通过工程化技术大规模生产和转化相应原料成为有用物质的技术,酶工程的主要内容,酶的分离纯化酶与细胞的固定化技术及反应器酶制剂的发酵生产酶分子化学修饰、遗传突变及结构改造酶抑制剂与激活剂开发与研究人工设计与合成模拟酶及酶分子,发酵工程,发酵工程属于生物技术的下游技术，是工业化大规模培养细胞、生产生物制品的一种技术。 传统的发酵工程主要用于微生物。现代生物技术还包括动物、植物细胞和工程菌的发酵培养。,1、基因工程理论基础三大理论发现（1）20世纪40年代：证明了遗传物质是DNA 1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验20世纪20-30年代 确认自然界有DNA和RNA两类核酸，并阐明了核苷酸的组成 1944年O.T.Avery 肺炎球菌转化实验1952年A.D.Hershey和M.Cha-se 用DNA35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌,（一） 基因工程的诞生,E 基因工程的发展,肺炎双球菌转化实验,有荚膜（S型）,无荚膜（R型）非致病,（2） 1953年Watson和Crick ：DNA双螺旋结构（3） 19581971年：先后确立中心法则,破译64种密码子，揭示了遗传信息的流向和表达确定了遗传信息的传递方式,B 技术上的3大发明： 1“基因剪刀”限制性内切酶的发明 （1）20世纪4060年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。 （2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。 （3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯化了Hind，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。,Restriction enzyme,restriction endonucleaseenzyme that cuts DNA strands at specific sites,Ligase,enzyme used to join two pieces of DNA,2载体(“交通工具车子”)基因工程技术诞生的第二个技术准备 （1）有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个载体 将重组DNA送到宿主细胞中去。 （2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子）.50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。 （3）1972年 Berg 首次实现基因重组(将SV40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功)-第一个重组DNA分子，1980年诺贝尔化学奖 1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。,vector,an agent such as a plasmid used to transfer DNA into a host cell,Importance of E. coli,The “laboratory mouse” of bacteriaUsed in genetic engineering,3逆转录酶1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（？） (1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，13kb/基因，104，2.2*1011公里。 （2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。 （3）经过逆转录mRNAcDNA (complementory DNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。,1973年，Cohen等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落TcrNer -标志着基因工程的诞生。,第一个转化成功的重组DNA,基因工程的发展,E 基因工程的发展,1976年等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子somatostatin 14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中表达1977年 美国南旧金山由Boyer和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因（HGH）重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素1980年，美国/瑞士人，a干扰素基因；1984年，日本人，白细胞介素2（IL-2）；,（三） 基因工程的腾飞,1980年：显微注射培育出第一个转基因动物转基因小鼠， 1982年，美国，大鼠生长激素基因转入小鼠-巨鼠1983年，美国， 农杆菌介导培育出第一例转基因植物转基因烟草1990年，美国，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫缺陷症（SDID）1991年，美国倡导，人类基因组计划109bp，15年时间30亿USD；1997年，美国人，威尔英特克隆多利绵羊,基因工程药物的类型： 1.生长因子，如胰岛素，白细胞介素等； 2.活性蛋白因子，如干扰素等； 3.酶类，如链激酶，尿激酶等； 4.疫苗，如乙肝疫苗等； 5.抗体，用作治疗的人源化抗体； 6.诊断试剂。,胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素 EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体,已上市的基因工程药物,Benefits of Recombinant Bacteria,1. Bacteria can make human insulin or human growth hormone. 2. Bacteria can be engineered to “eat” oil spills.,Transgenic organisms,When an organism contains genes from other organisms.Example:A tobacco plant that containd DNA from a firefly.,The DNA of plants and animals can also be altered.,PLANTSdisease-resistant and insect-resistant crops2. Hardier fruit 3. 70-75% of food in supermarket is genetically modified.,Transgenic organisms,Gene from Arctic char fish inserted into tomato= Frost-resistant tomato,Transgenic plants,Usually cash crops such as cotton, corn, wheat, soybeans, etc.Often incorporates bacterial DNA to make the crop resistant to disease, pests, or chemicals.Ex: Bt corn,苏云金芽孢杆菌,How to Create a Genetically Modified Plant,1.Create recombinant bacteria with desired gene.2. Allow the bacteria to “infect the plant cells.3. Desired gene is inserted into plant chromosomes.,Selective Breeding,Breed only those plants or animals with desirable traitsPeople have been using selective breeding for 1000s of years with farm crops and domesticated animals.,Genetically modified organisms are called GMO,TRANSGENIC ANIMALSMice used to study human immune systemChickens more resistant to infectionsCows increase milk supply and leaner meat 4. Goats, sheep and pigs produce human proteins in their milk,Human DNA in a Goat Cell,This goat contains a human gene that codes for a blood clotting agent. The blood clotting agent can be harvested in the goats milk.,.,Transgenic Goat,Cloning,Clone: a member of a population of genetically identical cells produced from a single cell.1997: first mammal cloned. Dolly, the sheep.体细胞vs生殖细胞子代vs自己,2003 Canadian claim successful cloning attempt of a human.,How to Create Transgenic Animals,中国克隆猪中心,华大基因,基因编辑技术新突破,AAV 腺相关病毒ZFN 锌指核酸酶TALEN 转录激活样效应因子核酸酶CRISPR-Cas9 转录激活样效应因子核酸酶,TALEN -Mediated Gene Mutagenesis in Rhesus and Cynomolgus Monkeys. Cell Stem Cell, 13 February 2014;,Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos. Cell, 30 January 2014;,基因诊断与治疗,主要治疗遗传疾病，即由单基因突变或异常导致的疾病。将外源基因导入体内，修复或替换异常基因或弥补缺失的基因，通过表达这些外源基因，使病情减缓，以致达到治疗的作用，甚至有人提出，将基因导入受精细胞中，彻底修正错误的基因。,基因治疗 gene therapy 的方式基因置换基因修正基因修饰 产物补偿缺陷细胞基因失活 反义技术封闭基因,抑制有害基因对象 体细胞 生殖细胞,1990.9.14 首例基因治疗 4岁 女孩 严重免疫缺陷症(SCID)缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA) 2-脱氧腺苷含量升高，严重破坏免疫功能,ADA基因LN逆转录病毒载体 靶细胞为病人淋巴细胞，回输,Issues Write and Discuss,What do you think?,Risks from novel crops,Direct RisksToxicity to humans, livestock and wildlifeGene flow to other crops, wild relativesGene stacking,Indirect RisksChanges in management practicesChanges in patterns of land use,Must be viewed in the context of risks from what we do now,其实基因安全问题不只是基因工程技术带来的，本身在自然界的常规基因交流方式也存在，只不过基因工程技术会使基因的交流频率增加，交流的范围更大，速度更快。 正确的态度是既不能忽视，也不能害怕。,Current Policy Landscape,1. 国际组织 2000年卡塔赫纳生物安全协定书62国签署 2001年生物安全议定书 130多个国家签署 2003年生物技术食品的风险评估草案 226 个国家表示欢迎,2. 美国, 1992年美国FDA公布了转基因作物不需由FDA作市场前评价，除非它引起新的安全性问题。2000 年4月，坚持认为没有科学的证据之前不能将GMF作为一个新的食品级别 2000年1月美国政府对转抗虫基因玉米的种植颁布了限令，以防止害虫形成抗药性。美国环境保护局限令美国大部分玉米产区的农场主应至少种植20的传统玉米. 2001年7月出台了转基因食品管理草案规定，GMF在进入市场之前至少120天，生物工程制造商必须向FDA提出申请，提供相关资料，以确认此类食品与相应的传统产品具有等同的安全性,3. 欧盟,欧盟对GMF持反对态度，1998年提出转基因技术安全性之后，其反对态度更加强硬。他们对转基因技术培育的农作物、家畜以及再加工食品加以抵制，尤其对美国的转基因玉米已终止了进口，然而对于西班牙和德国的转基因玉米却没有采取措施 欧盟的法律由两项：欧盟理事会于1990年4月颁布法令，规定了转基因生物的批准程序；1997年5月新食品法规定对转基因产品必须贴标签,4. 其它国家,日本、澳大利亚、俄罗斯、加拿大、韩国、泰国、 巴西的政策基本与国际组织的相同，但是巴西最 近宣布在未查清转基因作物对环境的影响之前，暂时停止种植转基因大豆。发展中国家迫切需要解决粮食问题，对于高产的转基因产品表示欢迎，这些国家技术落后，没有相关的转基因成分的检测条件，对于标识问题也只能处于被动地位，基本是按国际组织的