《谷氨酸的生产工艺》PPT课件

谷氨酸生产工艺,第2页，共69页,主要内容,简介（性质、用途）；发酵机制；发酵流程；菌种；,培养基（淀粉制糖）；,发酵过程和方法（包括工艺控制等）；提取纯化；,谷氨酸，学名：-氨基戊二酸；其单钠盐：谷氨酸钠，商品名称味精，是重要的调味品。早期生产谷氨酸的方法有两种，一是提取法：甜菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处理可得到谷氨酸；二是蛋白质水解法：将面筋加酸水解，再分离提纯。1957年发酵法生产谷氨酸在日本协和发酵公司投产。日本在谷氨酸发酵生产方面居世界领先地位。味之素、协和等均是其中代表。我国发展也比较快，如河南的莲花味精公司，目前味精产量已从1983年的400吨上升到2010年的62万吨，单厂味精产量居世界第一位，国内市场占有率达43%；（广西的荷花味精）等。,一、谷氨酸简介,第3页，共69页,性质溶解性：微溶于冷水，易溶于热水，几乎不溶于乙醚、丙酮及冷醋酸中，也不溶于乙醇和甲醇，溶于盐酸溶液。等电点：3.22；,用途1、食品业谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。用于食品内，有增香作用。在食品中浓度为0.2%-0.5%，每人每天允许摄入量(ADl)为0120微克/千克(以谷氨酸计)。在食品加工中一般用量为0.21.5克/公斤。,2、日用化妆品等谷氨酸为世界上氨基酸产量最大的品种，作为营养药物可用于皮肤和毛发。用于生发剂，能被头皮吸收，预防脱发并使头发新生，对毛乳头、毛母细胞有营养功能，并能扩张血管，增强血液循环，有生发防脱发功效。用于皮肤，对治疗皱纹有疗效。,3、下游产品开发谷氨酸可生产许多重要下游产品如L谷氨酸钠、聚谷氨酸等。新型的聚合氨基酸，含有氨基的药物或靶向基因，可以方便的接入聚谷氨酸的分子中，形成大分子前药或靶向大分子载体，接入特异性的基因，可进行特殊的分离或提纯，这一聚合物在医药领域会有很广泛的应用前景。,4、医药行业谷氨酸还可以用于医药中，因为谷氨酸是构成蛋白质的氨基酸之一，虽然它不是人体必须的氨基酸，但它可作为碳氮营养与机体代谢，有较高的营养价值。谷氨酸被人体吸收后，易与血氨形成谷酰氨，能解除代谢过程中氨的毒害作用，因而能预防和治疗肝昏迷，保护肝脏，是肝脏疾病患者的辅助药物。脑组织只能氧化谷氨酸，而不能氧化其它氨基酸，故谷酰胺可作为脑组织的能量物质，改进维持大脑机能。谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂，对于治疗脑震荡或神经损伤、癫痫以及对弱智儿童均有一定疗效。用谷氨酸制成的成药有药用谷氨酸内服片，谷氨酸钠（钾）注射液，谷氨酸钙注射液，乙酰谷氨酸注射液等。,二发酵机制谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经EMP途径或HMP途经生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A，然后进入TCA，再通过乙醛酸循环、CO2固定作用，生成a-酮戊二酸，a-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下生成谷氨酸,第4页，共69页,第6页，共69页,谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量300多倍的谷氨酸，研究发现：大量积累并非是当初设想的由于特异代谢途径导致，而是：,代谢调节控制；,细胞膜通透性的特异调节；发酵条件的适合。,葡萄糖,6-磷酸葡萄糖,NADPH2,乙酰辅酶A,6-磷酸果糖,6-磷酸葡萄糖酸,5-磷酸核糖,3-磷酸甘油醛,果糖-1，6-二磷酸,苹果酸,丙酮酸,CO2,异柠檬酸,CO2,草酰乙酸,顺乌头酸,CO2,乳酸,NAD+NADH2,柠檬酸,NADP+,CO2,NADH2,NAD+,草酰琥珀酸,酮戊二酸,琥珀酸,延胡索酸,谷氨酸,NADPH2,NADP+,NADP+,NADPH2,乙醛酸,乙酰辅酶A,CO2,CO2,葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径,EMP途径,HMP途径,TCA循环,乙醛酸循环,天冬氨酸,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,第7页，共69页,在微生物的代谢中，谷氨酸比天冬氨酸优先合成。谷氨酸合成过量时，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的合成，使代谢转向合成天冬氨酸；天冬氨酸合成过量后，反馈抑制磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活力，停止草酰乙酸的合成。所以，在正常情况下，谷氨酸并不积累。见图327。,乙醛酸循环,GA生物合成的内在因素从上图可以看出，GA产生菌必须具备以下条件：1.KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失这是菌体生成并积累KGA的关键，从上图可以看出，KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，KGA才得以积累。,2.GA产生菌体内的NADPH的在氧化能力欠缺或丧失（1）如上图所示，NADPH是KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联的。（2）由于NADPH的再氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制KGA的脱羧氧化有一定的意义。3.产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶。该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。,4.菌体有强烈的L谷氨酸脱氢酶活性L谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强，该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联。,谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型，谷氨酸发酵时通过控制生物素亚适量，使最后一代细菌细胞变形、拉长，改变了细胞膜的通透性，引起代谢失调，使谷氨酸得以积累。谷氨酸高产菌株丧失或仅有微弱的a-酮戊二酸脱氢酶活,力，使a-酮戊二酸不能继续氧化；CO2固定反应的能力强，使四碳二羧酸全部是由CO2固定反应提供，而不走乙,醛酸循环，以提高对糖的利用率；谷氨酸脱氢酶的活力很强，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制和反馈阻,遏同时NADPH2再氧化能力弱，这样就使a-酮戊二酸到,琥珀酸的过程受阻，在有过量铵离子存在的条件下，a-酮戊二酸经氧化还原共遏氨基化反应而生成谷氨酸，生成的谷氨酸不形成蛋白质，而分泌泄漏于菌体外，谷氨酸产生菌不利用体外的谷氨酸，谷氨酸成为最终产物。,生物素亚适量的原因（2ug/L5ug/L）：,当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。,在谷氨酸发酵过程中，影响菌种代谢途径的因素见下表。,GA发酵的外在因素GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的菌体特性，但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。1.供氧浓度过量：NADPH的再氧化能力会加强，使KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。,2.NH4+浓度（1）影响到发酵液的pH值（2）与产物的形成有关：过低，不利于KGA的还原氨基化过高，产生固安酰胺NH4+的供给方式：（1）液氨（2）流加尿素,3.磷酸盐过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等（2）产生并积累Val，途径如下：Glucose丙酮酸+丙酮酸（焦磷酸硫胺素，TPP）活性乙醛乙酰乳酸Val,Val（1）可以抑制葡萄糖丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止（2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率（3）发酵液中的Val存在，严重的影响GA的结晶、提出。,谷氨酸产生菌因环境条件变化而引起的发酵转换,乳酸和琥珀酸,酮戊二酸,（通气不足）,（适中）,（通风过量，转速过快）,NH4+,酮戊二酸,谷氨酸,谷氨酰胺,（适量）,（缺乏）,（过量）,pH值,谷氨酰胺，N-乙酰谷酰胺,谷氨酸,（pH值58，NH4+过多）,（中性或微碱性）,磷酸,缬氨酸,谷氨酸,（高浓度磷酸盐）,（磷酸盐适中）,生物素,乳酸或琥珀酸,谷氨酸,（过量）,（限量）,第13页，共69页,三、菌种,日前用于谷氨酸发酵的菌种有谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌、嗜氨小杆菌、球形节杆菌。我国常使用的生产菌株是北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌A51.542、棒杆菌S-914和黄色短杆菌T6T13等。,在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有一些共同的特点，如菌体为球形、短秆至棒状、无鞭毛、不运动、不形成芽孢、呈革兰氏阳性、需要生物素做生长因子、在通气条件下培养产生谷氨酸。,第14页，共69页,菌种的定向选育,改变细胞膜的通透性：,生物素（乙酰CoA羧化酶的辅酶）营养缺陷型株丧失脂肪酸合成酶的油酸缺陷型；丧失a-磷酸甘油酶的甘油缺陷型。,选育温度敏感突变株：,例：使用典型的温度敏感突变株TS-88生产谷氨酸时，通过控制发酵条件，在生长适当阶段将发酵温度由30提高到40，可在生物素含量为33ug/L，含糖3.6%的甜菜糖蜜发酵培养基中，产生20g/L谷氨酸，对糖转化率55%。,第15页，共69页,四、培养基,碳源；氮源；,碳氮比；磷酸盐；,金属离子和无机盐。,第16页，共69页,碳源,碳源一般都是淀粉原料，如玉米、小麦、甘薯、大米等，其中甘薯和淀粉最为常用；淀粉原料要先通过制糖工艺水解成微生物可直接利用的葡萄糖，然后经过中和、脱色再投放到发酵罐；,糖蜜原料作为碳源，如甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。糖蜜因富含生物素，在发酵前需要经活性炭、树脂吸附和亚硝酸法吸附或破坏生物素。,第17页，共69页,淀粉制糖,原因；方法：,水解酶水解成糊精或低聚糖，糖化酶糖化成葡萄糖。,酸解法；酸酶法；酶酸法；双酶法。,国内多采用酸水解工艺。,第18页，共69页,淀粉酸水解工艺,调浆（液化）：1011波美，盐酸调pH1.5；糖化：直接蒸汽加热25min；冷却：80以下；,中和：一般中和中点的pH4.05.0，使蛋白质和其它胶体物质析出；,脱色：活性炭法或树脂法（注意条件方法）;过滤：过滤温度4550。,第19页，共69页,氮源,作用：合成菌体蛋白质、核酸及谷氨酸的原料；氮源比碳源对谷氨酸发酵影响更大，约85（30%80%）的氮源被用于合成谷氨酸，另外15（3%5%）用于合成菌体；,大多数氨基酸产生菌都不能分泌胞外水解蛋白酶，因此常用的有机氮源有玉米浆、豆饼、毛发、棉籽饼、麸皮等蛋白质原料的水解液；,有机氮源也是氨基酸发酵中重要的生长因子来源，对氨基酸合成途经具有调控作用。,第20页，共69页,谷氨酸发酵的碳氮比为100：(1521)，当碳氮比为100：11时才开始积累Glu。目前生产L-Glu多采用尿素作为氮源，进行分批流加，流加时温度不易过高（不超过45），否则游离氨过多，使初始pH值过高，抑制菌体生长；,适量的NH4+可减少a-酮戊二酸的积累，促进,Glu的合成；,过量的NH4+会使生成的谷氨酸受谷氨酰胺合成,酶的作用转化为谷氨酰胺。,第21页，共69页,无机盐,磷酸盐在谷氨酸发酵中非常重要，它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度要适中。,浓度过高，抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，菌体生长好，Glu产量低，代谢转向Val发酵；浓度低，糖代谢受抑制，糖耗慢。,K+：多时利于产酸，少时利于长菌;Mn2+：草酰琥珀酸脱羧生成a-酮戊二酸是在,Mn2+存在下完成的（MnSO44H2O2ppm）；,Fe3+:促进Glu产生；Cu2+：毒害作用。,第22页，共69页,生长因子,“亚适量”的生物素（2ug/L5ug/L）；,实际生产中常通过筋加玉米桨、麸皮水解液、糖蜜等作为生长因子的来源，来满足谷氨酸生产菌必需的生长出子。,第23页，共69页,生物素对谷氨酸发酵的影响,生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的生物合成，进而影响磷脂的合成。当控制生物素在亚适量时，脂肪酸合成就不完全，导致磷脂合成不完全。而细胞膜是由磷脂双分子层组成的，当磷脂含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出、积累于发酵液中。如果生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。,五,发酵过程和控制,谷氨酸生产菌经活化、一级种子、二级种子扩大培养，接入发酵罐中，在3238、pH7.0左右的条件下，好氧发酵30h左右；第24页，共69页,第25页，共69页,接种龄和接种量,一般情况，一级种子种龄控制在11h12h，二级种子种龄控制在7h8h。一般接种量为0.6%1.7%。,第26页，共69页,温度,前期（菌体生长）3032；后期（Glu合成）3437；,前期：如果温度过高、菌种易衰老，严重影响菌体生长繁殖。如遇此情况，除维持最适生长温度外还需适当减少风量，并采取少量多次流加尿素等措施；,在发酵后期，菌体生长基本结束，为了满足大量生成谷氨酸，可适当提高温度，控制在3437。,第27页，共69页,发酵前期pH值,发酵前期：,由于幼龄细胞对pH较敏感，如果控制pH过低，菌体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵慢，长菌不产酸；如果pH值过高，虽然有利于抑制杂菌生长，但对菌体生长不利，糖代谢缓慢，发酵时间延长。,发酵前期，菌体生长的适宜pH值为7.5左右。,第28页，共69页,发酵后期pH值,发酵后期：,由于谷氨酸脱氢酶最适pH为7.07.2，转氨酶最适pH7.27.4，所以在发酵中后期，为了促进谷氨酸的生成，应尽可能保持发酵液pH7.2左右。pH过高(pH7.58.0)：谷氨酸就有可能转变成谷氨酰胺，且易使菌体自溶；,pH过低(pH7.0以下)：NH4+供应不足，a-酮戊二酸不能还原氨基化产生谷氨酸，这样就会使发酵液a-酮戊二酸量增加，谷氨酸产量降低。,第30页，共69页,pH值控制,尿素流加法；氨水流加法；,流加尿素数量和时间的依据：pH值变化、菌体生长、糖耗、发酵阶段。发酵前期：,菌体生长和糖耗均快时：多流加尿素pH值高抑制生长；,菌体生长和糖耗均慢时：少流加尿素。,第31页，共69页,pH值控制,发酵后期：,残糖少，接近放罐时，尽量少加或不加尿素，以免浪费和增加提取的困难；,发酵后期，一般少量多次地流加尿素，使pH值较稳定。,菌种不同所具有的脲酶活力和耐尿能力不同，尿素流加方法就有所不同。,例如ASl299菌的脲酶活力比较弱，耐尿能力强，初尿用量可高些，流加尿的次数少，流加量多些。T613菌的脲酶活力强，初尿用量要少，流加尿素以少量多次为好。,供氧过多，菌体呼吸加快，细胞代谢处在过分激烈状,供氧不足，糖酵解至丙酮酸时；难于进入三羧酸循环，丙酮酸积累量增加，或还原成乳酸；供氧过量，影响还原氨基化反应，致使大量积累a-酮戊二酸；而谷氨酸产量很低。第32页，共69页,供氧对谷氨酸发酵的影响与控制供氧不足，培养基处于缺氧状态，菌体生长受抑制；菌体,生长,阶段态，抑制菌体生长，而且容易衰老；,产酸阶段,第33页，共69页,谷氨酸发酵过程，长菌与产酸要求供氧不同。,长菌阶段所需溶氧系数为,Kd4610-7molO2，(ml-1min-1大气压-1)；,产酸阶段所需溶氧系数,Kd1.4610-7molO2，(ml-1min-1大气压-1)。,第34页，共69页,通气与搅拌,溶氧大小的控制：通气与搅拌来完成。,通风比是指对1m3发酵液每分钟通入无菌空气的量(m3)。发酵处于不同阶段，通风比也不相同，前期通风量小，主期通风量大，后期通风量小。,搅拌是使溶氧效果更好，搅拌比通气对溶氧的影响更大。搅拌效果与搅拌器的类型，搅拌器曲直径大小，搅拌转速、搅拌器在发酵罐内的相对位置等有关。,第35页，共69页,通风量,前期：如果通风量过大，而生物素缺乏，会抑制菌体生长，表现出耗糖慢、pH高、长菌不快的现象，所以前期通风量不宜过大；,中后期：在发酵产酸阶段，需要大量供氧，如通气量不足，往往表现出pH低，耗糖快，长菌不产酸，而积累乳酸和琥珀酸。但通气量过大，也不利于a-酮戊二酸进一步还原氨基化，所以大量积累a-酮戊二酸。因此，只有在适量通气条件下，才有可能大量积累谷氨酸。中后期以高通风量为宜。,第36页，共69页,防止噬菌体和杂菌的污染,谷氨酸生产菌一般都是生物素缺陷型，而在发酵培养基中又大多是控制生物素亚适量，所以谷氨酸生产菌对噬菌体和杂菌的抵抗能力较弱。最怕污染噬菌体，轻则出现谷氨酸收率低、难提取，重则倒罐，造成很大的经济损失。所以，杂菌和噬菌体的防治工作就显得特别重要。一定要从空气过滤、培养基、设备、环境等环节严格把关。,第37页，共69页,斜面培养基组成：,葡萄糖0.1蛋白胨1.0牛肉膏1.0氯化钠0.5,琼脂2.02.5pH7.07.2（传,代和保藏斜面不加葡萄糖，为了利于菌体生长而不产酸）,培养条件：,7338、B9类菌种3032，培养1824h；T613类菌种3334，培养1824h。,检查：培养完成后，要仔细观察菌苔生长情况，菌苔的颜色和边缘等特征是否正常，有无感染杂菌和噬菌体的征象。,菌种斜面培养,第38页，共69页,培养基：葡萄糖2.5，尿素0.5，硫酸镁0.04，磷酸氢二钾0.1，玉米浆2535(按质增减)硫酸亚铁、硫酸,锰各2ppm，PH6.56.8(培养基成分可因菌,种不同酌情增减)。,培养条件：培养温度7338和B9类菌30一32、T613类菌种3334，摇床上振荡培养12小时。,一级种子培养,一级种子质量要求,种龄：12hpH值：6.401光密度：净增OD值0.5以上,残糖：0.5以下无菌检查：(一)噬菌体检查：无镜检:菌体生长均匀粗壮，排列和整齐革兰氏染色：阳性第39页，共69页,第40页，共69页,根据菌体生长情况，酌情增减生物素等用量，随时调整培养基组成。,二级种子培养,接种量,O810,培养温度32(T613菌为3334)培养条件,培养时间,78h,通风量,50L种子罐,1：0.5,搅拌转速250L种子罐搅拌转速300500L种子罐搅拌转速,340rmin1:0.3rmin1：0.25230rmin第41页，共69页,二级种子的质量要求,种龄：78hpH：72左右OD值：净增0.5左右,无菌检查：(一)噬菌体检查：无残糖：消耗1%左右镜检：生长旺盛，排列整齐革兰氏染色：阳性第42页，共69页,第44页，共69页,Glu发酵的四个阶段,适应期；,对数生长期；转化期；产酸期。,第45页，共69页,适应期,细胞利用贮存物质合成大分子物质和所需能,量，菌体个体长大但没有分裂；,糖等基质基本不耗或很少消耗，pH值稍为上,升是由于尿素分解放出氨所致；,适应期的长短取决于菌种活力、种子量、发酵培养基和发酵条件等一般为2h左右。但采用高生物素、大种量、添加青霉素工艺时适应期非常短。,第46页，共69页,对数生长期,长菌阶段，极少产谷氨酸，一般发酵38h或410h；菌浓度：菌体大量繁殖，OD(光密度)直线增长；,菌体形态：与二级种子相同，绝大多数为“V”形分裂；基质变化：耗糖速度逐渐加快，尿素被脲酶分解放出氨使pH上升，氨被菌体利用又使PH下降，这时必须及时流加尿素，补充氮源和调节PH值；,温度：由于菌体代谢活动，放出热，温度开始上升，一般发酵5h左右温度开始上升，应该注意降温；,通风：排气中CO2浓度显著增加，耗氧量很快增加，培养液中的溶解氧下降，提高通风量；,但在对数末期要加大风量供给充足氧和及时施加尿素供给充分氮源促进增殖型菌体向生产型转化。,第47页，共69页,菌体由增殖型向生产型转化的时期，时间约为814h,或1018h；,部分菌体体内生物素含量由“丰富转向贫乏”，此部分菌就停止繁殖，在条件适宜时，开始伸长，膨肥形成生产型细胞，开始积累谷氮酸。,菌体数量：达到最大值；,菌体形态：“v”字形和伸长、膨大菌形同时存在，且,伸长菌体不断增加；,代谢最旺盛阶段，耗糖加快，谷氨酸生成迅速增加，耗氧速率加快，并接近最大值，放热也达最大值。,转化期,第48页，共69页,发酵控制：必须充分供氧，通风量达最大值，充分供给氮源，应注意降温冷却，泡沫显著增加。对发酵控制来说，此时期以前的控制是发酵成败之关键。此时期的变化受生物素和风量的明显影响。,当生物素过量时，没有明显的转化期，长菌不产酸，耗糖快，耗尿快。,若生物素太少，菌的数量不足，产酸低，周期长；如果通风不足，菌体的代谢转积累乳酸。,谷氨酸发酵中生物素用量与供氧能否巧妙地配合好在一阶段中明显地反映出来。,第49页，共69页,菌体完成由增殖型向生产型转化后，菌形几乎都,变长、膨大，边缘不完整，像花生形;,大量累积谷氨酸，耗糖与产酸相适应，产酸达最,大值，对糖转化率达5065；,应继续流加尿素，保证有充足的氮源；,pH值维持7.07.2；,适当提高温度，一般为3637；,在发酵后期耗氧量减少，可适当降低风量。流加尿素以少量为好，控制pH值6.87.0。当残糖降到1，根据发酵情况可将风量降到最低，促进中间产物转化成谷氨酸。,产酸期,第50页，共69页,六、谷氨酸的提取,发酵醪液的组成：溶解的谷氨酸、菌体、