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酸性磷酸酶Km及Vmax值测定清洗试管24支,酸性磷酸酶：催化磷酸单酯的水解反应存在于人的肝脏，前列腺等处植物中以发芽的种子中含量最为丰富。是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指标。,一、概述,酶液磷酸苯二钠苯酚磷酸氢二钠folin-酚测定酚的浓度计算出反应速度（用产物生成量/min来表示）根据双倒数法计算出Km及Vmax,二、实验原理,三、实验步骤：1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线3、制作酚标准曲线4、S与V0关系实验5、双倒数作图法计算Vmax和Km,buffer,substrate,enzyme,CertainTime,blank,Stopthereaction,Colordeveloped,生化实验课老师：于晓虹实验报告请交到讲台上来酶液稀释取上清液微升，稀释倍，用大试管装科代表李博恒,1、磷酸酶原液的制备：称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤，取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。上清液用pH5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实验。,2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线（目的：选取合适的反应时间）,加液程序表管号1234560磷酸苯二钠0.50.50.50.50.50.50.5酶液0.50.50.50.50.50.5精确反应时间3510152025碳酸钠溶液2222222酶液0.5Folin酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5Folin酚溶液已稀释好！注：进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始,35保温10分钟,结果：,以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间范围。,3、制作酚标准曲线（目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相当的酚含量,并计算出反应速度（用每分钟产物生成量来表示）,加液程序表,35保温10分钟,结果：,以酚含量（mol）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线。,以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度（A680nm）。,4、S与V0关系实验,实验加液程序表管号1234560磷酸苯二钠0.100.150.200.250.300.500.50醋酸缓冲液0.400.350.300.250.20-酶液0.500.500.500.500.500.50-精确反应15分钟35度碳酸钠溶液2222222Folin酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5酶液0.535保温10分钟测680nm处吸光度注：进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始,实验中需注意事项：酶反应作用时间精确控制,实验结果,1、酚含量从酚
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