实习二红细胞、网织红细胞检测.ppt

实验诊断实习二红细胞、网织红细胞检测,目的和要求,熟悉正常红细胞和网织红细胞的形态学特点掌握血红蛋白测定方法、参考值和临床意义掌握血细胞多参数报告单的正常值及其增减的临床意义,红细胞计数(redbloodcellcount),红细胞计数是取一定微量血液，经稀释后计算出血液内所含红细胞数目原理：用等渗稀释液将全血稀释至一定倍数，充入血细胞计数池，在光学显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经换算求出每升血液中的红细胞数量方法：显微镜计数法,器材及试剂：,取血吸管，一次性定量采血管(20ul)计数板：是一块厚玻璃制成，板上刻度分为9个大方格面积为Imm2。中央大方格用于红细胞计数，被双线等分成25个中方格，每个中方格又划分为16个小方格。计数板与盖玻片组成计数池，计数池深度为0.1mm显微镜、盖玻片、刺血针、棉花等小试管、刻度吸管、红细胞稀释液。其它:75%酒精棉球及干棉球,操作:,取血：选择耳垂边缘或指端，先用75%酒精棉球消毒局部皮肤。等待干后，用消毒后的刺血针刺入皮肤，深约2毫米。待血液从针孔流出，用于棉花擦去第一滴血轻轻挤压，使血液流出形成绿豆大小的血滴。操作者用右手平拿取血吸管尖端浸入血滴中，缓缓吸血恰至“10”刻度处为止。然后用干棉花擦净吸管外沾附的血液,稀释及混匀先准备一清洁小试管，精确滴入红细胞稀释液1.99毫升，备用将取好的血液立即挤入上述试管中，并来回吸取小量稀释液数次，以便将残余在吸管中的血液全部洗净摇动试管，充分混匀。此时血液被稀释200倍,充池先将计数板及盖玻片擦干净，并将盖玻片复盖于计数池上面。用吸管吸取己充分混匀的稀释血液一滴，滴于盖玻片的下方边缘处，稀释血液即充填入计数池中。注意勿发生气泡或使稀释血液流入计数池旁小槽内静置23分钟，待红细胞完全下沉稳定后进行计数,计数平放计数板于显微镜台上，先用低倍镜找到计数池的中央大方格。观察红细胞是否均匀，并调整至视野中间。再转换高倍镜计数。镜下红细胞为圆形或盘形、略带黄色的细胞。如将上侧线和左侧线上的红细胞都计数在内，则不要再将下侧和右侧线上的细胞计入。计数时必须按一定方向和顺序，以免将红细胞重复计数或漏数。计数5个中方格(即四角的及中央的中方格)由红细胞总共的个数，将其结果乘以10。即得每立方毫米血液中所含红细胞数目，再乘以10。即得每升血液中所含红细胞数目。,每升血液中红细胞数目=五个中方格内红细胞个数5(变为0.1u1)10(变为1u1)106(变为1L)200(稀释倍数)=五个中方格内红细胞个数1010清洁仪器：计数后，将盖玻片及计数板用水冲洗干净，再用绸或细布擦干吸管先用蒸馏水，继用95%酒精，后用乙醚洗涤干净，保存备用,注意事项,不能在有水肿、炎症、淤血等部位或刺血过浅处采血所用吸管、试管、滴管及血细胞计数板须干净无水操作迅速，充池一次完成，不能有气泡红细胞分布不均，每个中方格之间相差大于20个时要重新充池计数,血红蛋白测定,方法：氰化高铁血红蛋白测定法原理：血红蛋白(Hb)被高铁氰化钾K3Fe(CN)6氧化为高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰离子结合成氰化高铁血红蛋白（HiCN）HiCN在540nm有一吸收峰测定其光密度而得血红蛋白浓度,试剂与器材,器材：分光光度计试管，试管架取血吸管:一次性定量采血管(20ul)刺血针蒸馏水75%酒精及干棉球,试剂：氰化高铁血红蛋白稀释剂高铁氰化钾K3Fe(CN)6200mg氰化钾（KCN）50mg无水磷酸二氢钾140mgTritonX-1001.0ml用蒸馏水溶解并稀释至1L,该试剂应呈透明、淡黄色，pH在7.07.4之间，以蒸馏水作空白，在540nm比色，读数是0溶液应放置棕色试剂瓶中，塞紧后保存于冰箱中（但不宜冻结），至少可稳定数月如发现试剂变绿、浑浊则不能使用其中非离子表面活性剂可加速溶血，缩短转化时间，防止血浆蛋白改变引起的浑浊,实验步骤,在试管中准确加入HiCN稀释试剂5.0ml，作为测定管用血红蛋白吸管准确吸取全血20u1，擦去管端血迹，置于试剂中，冲洗3次，混匀将混合液放置3分钟以后，倒入光径1cm比色皿，用分光光度计在540nm进行比色以蒸馏水或HiCN稀释试剂作空白管，校正光密度到0点，读取测定管光密度读数,计算：血红蛋白（g/L）=测定管光密度（64458/44000）251=测定管光密度A367.7式中：（1）64458是目前国际公认的血红蛋白分子量（2）44000是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩尔吸光度（3）251是稀释倍数,方法评估,HiCN法操作简便，试剂单一，显色快且稳定，可以根据吸光度直接计算结果被列为国际血红蛋白测定的参考方法，也是我国推荐的首选方法高球蛋白血症和白细胞明显增高可导致反应液浑浊而影响结果,注意事项,用吸血管吸血过程应仔细、认真，准确把握住吸入的血液量是初学者的一个难点，也是实验结果准确与否的一个关键HiCN稀释液不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN含量下降，测定结果偏低应贮存在棕色有塞玻璃瓶中4冰箱保存一般可用数月，但不能在0以下保存，因为结冰可引起高铁氰化钾还原，使溶液褪色失效,注意事项,分光光度计使用要点1、开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调置使用波长。仪器预热20分钟。2、打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”。盖上试样室盖，将比色皿架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”。3调整仪器的“00.0”和“100%”，将选择开置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度的值。,注意事项,氰化钾是剧毒品，配制稀释液时要按剧毒品管理程序保管、操作配制好的HiCN稀释液中因氰化钾含量低，又有高铁氰化钾存在，毒性不是很大。若进入体内，高铁氰化钾氧化血红蛋白，生成高铁血红蛋白。后者结合CN，起到一定的解毒作用，但仍应妥善保管测定后的废液不能与酸性溶液混合氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中应注意废液处理，可用除毒液除毒,除毒方法取硫酸亚铁（FeSO47H2O）二份加NaOH一份，在研钵中研细，配成100g/L的悬液。每1000ml废液加上述除毒液5ml，放置3小时，不时搅拌，使剧毒的氰化钾成为无毒的亚铁氰化钾废液加入等量的水，混合后每升加次氯酸铋液(安替福化)35毫升，充分混匀后敞开容器，置室温15小时后，排入下水道,参考值多次检查,临床意义,红细胞及血红蛋白增多单位容积血液中RBC及血红蛋白量高于参考高限可分为相对性增多和绝对性增多两大类红细胞及血红蛋白减少单位容积循环血液中RBC、血红蛋白量及红细胞比积低于参考值低限，称为贫血。贫血可概括为两大类：即生理性减少和病理性减少各种贫血红细胞与血红蛋白的减低不一定呈平行关系,RBC与Hb小结,RBCHb,增多,减少,相对增多,绝对增多,原发增多,继发增多,Epo代偿性增多,Epo非代偿性增多,缺氧,肿瘤,真性红细胞增多症,脱水,生理性减少,病理性减少,儿童，孕妇，老人,生成减少,破坏增加,丢失过多,各种溶血,各种失血,造血干C障碍,DNA合成障碍,再障,巨贫,Hb合成障碍,多种机制,缺铁贫,白血病,造血原料缺乏,RBC与Hb小结,网织红细胞计数,原理网织红细胞是晚幼红细胞脱核后但尚未完全成熟的红细胞胞质中尚有核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质残存,经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后,胞质中可见蓝或蓝绿色枝点状甚至网织状结构,取材：人的外周血液（涂片）方法：煌焦油蓝活体染色法近年来还可通过某些血液自动分析仪及流式细胞术检测法进行网织红细胞计数操作：取一滴血与煌焦油蓝染液混合，制成涂片在油镜下，观察红细胞胞质内蓝色的丝网状结构计数1000个红细胞，求得其中网织红细胞百分数,染色及涂片要点,在洁净载玻片上加1煌焦油兰酒精液一滴；待干取新鲜血液一滴，滴于载玻片的染液上，轻轻搅拌保持载玻片上血液不致干涸，染色5分钟或更长常规涂片方法，推成薄而均匀的血膜片，自然干燥,8