《蛋白质的通论》PPT课件

第4章蛋白质的共价结构,教学目的与要求：了解蛋白质含量测定法、蛋白质分类方法、蛋白质一级结构与功能关系，掌握蛋白质结构层次特点、肽键特性及肽的物理化学性质、蛋白质一级结构结构测定步骤和方法、肽与蛋白质的人工合成，能解决一些关于肽与蛋白质结构测定与合成的问题。教学重点：蛋白质一级结构、肽的物理化学性质、蛋白质一级结构结构测定步骤和方法教学难点：蛋白质一级结构、肽的物理化学性质,蛋白质是一类重要的生物大分子，英文名称叫做protein，汉文译为蛋白质。蛋白质在生物体内占有特殊的地位，蛋白质和核酸是构成细胞内原生质的主要成分，而原生质是生命现象的物质基础。,第4章蛋白质的共价结构,蛋白质蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。蛋白质在生命中的重要性早在1878年，思格斯就在反杜林论中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。,一、蛋白质通论,1.蛋白质是生物体内必不可少的重要成分,蛋白质占干重人体中（中年人）人体45%水55%细菌50%80%蛋白质19%真菌14%52%脂肪19%酵母菌14%50%糖类1%白地菌50%无机盐7%,2.蛋白质是一种生物功能的主要体现者,（1）酶的催化作用（2）调节作用(多肽类激素)（3）运输功能（4）运动功能（5）免疫保护作用(干扰素)（6）接受、传递信息的受体（7）毒蛋白,3.外源蛋白质有营养功能，可作为生产加工的对象,蛋白质的组成,元素组成：碳50、氢7、氧23、氮16、硫03、其他微量蛋白质的平均含氮量：16，凯式定氮法测量蛋白质含量的基础蛋白质含量蛋白氮6.25（6.25即16的倒数，为1g氮所代表的蛋白质量（克数）。,按组成分：,蛋白质的分类,单纯蛋白质：完全由氨基酸构成，根据其物理性质进行分类缀合蛋白质：氨基酸辅基（非蛋白），根据其非氨基酸成分进行分类,按生物学功能分：酶、调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白等按形状分：纤维状蛋白质、球状蛋白质、膜蛋白按肽链的多少（相对分子质量）分：单体蛋白质、寡聚蛋白质（多聚蛋白质）,蛋白质的形状,蛋白质的大小与分子量,蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。,蛋白质分子量的变化范围很大，从大约6000到1000000道尔顿（Da）或更大。某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。,蛋白质通论,单体蛋白质：仅由一条多肽链构成寡聚蛋白质：两条或多条多肽链构成，其中每条多肽链称为亚基，亚基之间通过非共价键相互缔合不含辅基的蛋白质，用110除它的相对分子质量即可估计其氨基酸残基的数目。（蛋白质氨基酸的平均相对分子质量约为138，但在多数蛋白质中较小的氨基酸占优势，因此平均相对分子质量接近128，形成肽键时除去一分子水，所以氨基酸平均相对分子质量128-18110）,蛋白质的构象,蛋白质的构象：每一种天然蛋白质都有自己的特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常称为构象。构象形态间的改变不涉及共价键的破裂。构型的改变必需通过共价键的破裂的改变。,蛋白质的结构层次,一级结构：基本结构，多肽链的氨基酸序列，由肽键连接而成的结构。二级结构：多肽链主链构象主要动力：氢键主要形式：螺旋、折叠三级结构：多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。四级结构：寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。一级结构决定高级结构，高级结构决定蛋白质功能。,蛋白质的结构层次,蛋白质功能的多样性,二肽（peptide）,一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,（一）肽、肽键与肽平面,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由几个到几十个氨基酸组成的肽称为寡肽，由更多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。,肽键（peptidebond）,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。,0.127nm键长=0.132nm0.149nm,肽键平面的形成,肽键,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。C-N键约有40的双键性质，而C-O键具有40单键性质。组成肽基的4个原子和2个相邻的C原子倾向于共平面，形成肽平面。两个C可以处于顺式构型或反式构型。在大多数情况下，以反式结构存在。但脯氨酸形成的肽键除外，可以是顺式，也可以是反式的。,肽单位,多肽链是由许多氨基酸残基通过肽键彼此连接而成的。多肽链主链骨架的重复单位就是肽单位，它是由肽键的4个原子与相连的两个碳原子组成的基团。,肽单位结构基本上是固定的，有下列特征：1.肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。肽键中的C-N键的键长为0.132nm，比大多数其他化合物的C-N单键（0.149nm）短，比C=N双键（0.127nm）又长些。因此，肽键具有部分（约40）双键性质；具有刚性，不能自由旋转。,2.肽单位是刚性平面结构。即肽单位的6个原子都位于同一个刚性平面上，又称肽平面或酞胺平面。3.肽单位中，C=O与N-H或两个碳原子呈反式排布。这是因为反式构型的能量比顺式构型的能量低。4.肽单位平面结构有一定的键长和键角。,0.127nm键长=0.132nm0.149nm,肽链中AA的排列顺序和命名,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链主链的一端含有一个游离的氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的羧基，称为羧基端或C-端。如果多肽链主链末端的氨基和羧基连接起来，则称环状肽或环肽。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。肽的命名是根据参与其组成的氨基酸残基来确定的，规定从肽链的NH2末端氨基酸残基开始，称某氨基酰某氨基酰某氨基酸。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰氨,四肽的结构,（二）肽的重要理化性质,1.熔点高。这说明它和氨基酸一样，是以偶极离子形式形成离子晶格而存在的。2.具有酸碱两性性质和等电点。肽的酸碱性质主要来自游离末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链R上可解离的基团。每一种肽都有其相应的等电点。,3.具有旋光性。这是由于肽中有不对称C原子存在。一般短肽的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度的总和。但是较长的肽，其旋光度则不等于其组成氨基酸的旋光度的简单加和。4.具双缩脲反应。这是肽和蛋自质所特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应。一般含有两个或两个以上肽键的化合物与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物，利用此反应借助分光光度法可测定肽或蛋白质含量。,5.具紫外吸收。如果肽中存在有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，则在280nm处有最大吸收峰。利用这个特性可对肽类进行定量测定。6.其他反应。由于肽中存在游离的-NH2和游离-COOH，所以能进行茚三酮反应、酰化反应、酯化反应等许多反应。,在给定的pH下，根据HendersonHasselbalch方程不难确定出每个侧链占优势的电离态。我们只需掌握这样一个规则：当溶液pH大于解离侧链的PKa值，占优势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液的pH小于解离侧链的PKa值，占优势的离子形式是它的共轭酸，即：,（三）天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，生物体也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽（activepeptide）。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,与真核生物的RNA聚合酶牢固结合,三蛋白质的一级结构的测定,1.定义1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,2.蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,a、样品必需纯（97%以上）；b、知道蛋白质的相对分子量；c、知道蛋白质由几个亚基组成；,（1）测定蛋白质一级结构的要求,蛋白质一级结构的测定,测定多肽链的数目,蛋白质测序的步骤,拆分多肽链,断开多肽链内的二硫键,测定每一肽链的氨基酸组成,鉴定多肽链的N-末端和C-末端,裂解多肽链为较小的肽段,测定各肽段的氨基酸序列,利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构,确定二硫键的位置,(2)测定步骤,A.测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,B.多肽链的拆分由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度盐处理，即可分开多肽链(亚基)；如果多肽链间是通过共价二硫桥连接的，如胰岛素，可采用氧化剂或还原剂将二硫键断裂。,(2)测定步骤,C.二硫键的断裂多肽链间或内通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（如，ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,S,S,S,S,S,S,胰岛素,HO-CH2-CH2-SH,SH,SH,SH,SH,SH,SH,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,ICH2COOH,-巯基乙醇,二硫键的断裂,巯基（-SH）的保护,D氨基酸组成的分析,蛋白质的组成分析可用酸水解，同时辅以碱水解。水解中氨基酸遭破坏的程度与保温时间呈线性关系，因此该氨基酸在蛋白质中的真实含量可通过不同的保温时间测出样品中该氨基酸的含量并外推出至零时间的含量的方法求出。蛋白质的氨基酸组成一般用每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数表示，或用每100g蛋白质中含氨基酸的克数表示。,测定每条多肽链的氨基酸组成,(2)测定步骤,E.分析多肽链的N-末端和C-末端。多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,蛋白质一级结构的测定,Sanger法：2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-多肽或DNP-蛋白质）。DNP-多肽在酸性条件下水解，只有N-末端氨基酸为黄色DNP-氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。只要鉴别所生成的DNP-氨基酸，就可得知N-末端氨基酸。该产物能够用有机溶剂（如乙醚、乙酸乙酯）抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,N-末端基氨基酸测定,二硝基氟苯（DNFB）法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，DNS）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol，比DNFB法高100倍。DNS-氨基酸不需要抽提，可直接用纸电泳或者薄层层析加以鉴定。,N-末端基氨基酸测定,丹磺酰氯（DNS）法,多肽或蛋白质的末端氨基能与PITC（Edman试剂）作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，简称PTC-多肽或PTC-蛋白质。后者在酸性有机溶剂中加热时，N一末端的PTC一氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N-末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的，因为PTC基的引入只使第一个肽键的稳定性降低。反应液中代表N-末端残基的PTH-氨基酸，经有机溶剂抽提干燥后，可用薄层层折、气相色谱和HPLC等进行鉴定。此方法还可以用来测定氨基酸序列。,苯异硫氰酸酯（PITC）法,N-末端基氨基酸测定,氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，它们能从多肽链的N末端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N-末端残基序列。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶（LAP），亮氨酸氨肽酶不是只能水解以Leu为N-末端残基的肽键，只是水解以Leu为N-末端的肽键速度为最大。,氨肽酶法,N-末端基氨基酸测定,序列是Gly-Ser-Val,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。游离的C-端氨基酸可用FDNB法或DNS法及层析技术进行鉴定。肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破坏不易测出，C-末端的精氨酸转变为鸟氨酸。,C-末端基氨基酸测定,肼解法,还原法,C-末端基氨基酸测定,肽链C一末端氨基酸也可用硼氢化锂还原成相应的-氨基醇。肽链完全水解后，代表原来C-末端氨基酸的-氨基醇，可用层析法加以鉴别。,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。,C-末端基氨基酸测定,羧肽酶(carboxypeptidase)法,目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,羧肽酶(carboxypeptidase)法,C-末端基氨基酸测定,（2）测定步骤,F.多肽链断裂成多个肽段可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,多肽链断裂法：酶解法和化学法,酶解法:最常用的蛋白水解酶：胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，又叫肽链内切酶或内肽酶。,多肽链的选择性降解,Trypsinase：R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。,肽链,水解位点,胰蛋白酶,有时待测的多肽链中赖氨酸残基和（或）精氨酸残基的数量较多，为了减少胰蛋白酶的作用位点，可以通过化学修饰将其侧链基团保护起来。例如用马来酸酐（即顺丁烯二酸酐）可以保护Lys残基侧链上的-NH2，这样胰蛋白酶就不会水解Lys残基的羧基端肽键，只能断裂Arg残基羧基端的肽键。反之，如果用1，2-环己二酮修饰Arg的胍基，则胰蛋白酶只能断裂Lys残基羧基端的肽键。如果想增加多肽链中胰蛋白酶断裂点，可以用氮丙啶处理多肽链样品，这对Cys残基侧链被修饰成类似Lys的侧链，也具有-NH2。这样，胰蛋白酶便能断裂Cys残基羧基端的肽键。,胰蛋白酶,或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe,Trp,Tyr时水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。,肽链,水解位点,糜蛋白酶,Pepsin：R1和R2Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro不水解。,肽链,水解位点,胃蛋白酶,thermolysin：R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑。,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,木瓜蛋白酶,R1=Arg或Lys,前者又叫谷氨酸蛋白酶：R1=Glu、Asp(pH7.8磷酸缓冲液);R1=Glu(pH7.8碳酸氢铵缓冲液或pH4.0醋酸铵缓冲液)后者又叫精氨酸蛋白酶：R1=Arg,肽链,水解位点,葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶,化学法：可获得较大的肽段溴化氰(Cyanogenbromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。,（2）测定步骤,G.分离肽段,测定每个肽段的氨基酸顺序。,Edman（苯异硫氰酸酯PITC法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。,Edman氨基酸顺序分析法,Edman降解法现在已有多种改进形式。例如DNSEdman测序法，它是用前述的DNS法测定肽链的N一末端贱基，用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链样品。此外为提高检出被释放残基（PTH一氨基酸）的灵敏度，采用荧光基团或有色基团等标记的PITC试剂，如4一N，N一二甲氨基偶氮苯4，异硫氰酸酯（缩写为DABITC）就是改进的有色Edman降解试剂。,生成的PTH氨基酸在紫外区有强吸收，可利用各种层析技术分离。,测定每条多肽链的氨基酸组成,（2）测定步骤,H.确定肽段在多肽链中的次序利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,示例(十肽的水解),A法水解得到四个小肽：A1Ala-PheA2Gly-Lys-Asn-TyrA3Arg-TyrA4His-ValB法水解得到三个小肽：B1Ala-Phe-Gly-LysB2Asn-Tyr-ArgB3Tyr-His-Val,N-末端残基HC-末端残基S第一套肽段第二套肽段OUSSEOPSWTOUEOVEVERLRLAAPSHOWTHO氨基酸顺序怎样排列？,（2）测定步骤,I.确定原多肽链中二硫键的位置,采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳定,一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。,二硫键位置的确定,S,S,HCOOOH,SO3H,SO3H,+,-,+,-,第二向,第一向,ab,Brown和Hartlay对角线电泳图解,pH6.5图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段,将每对含磺基丙氨酸的肽段取下，进行氨基酸序列分析，然后与多肽链的氨基酸序列比较，即可推断出二硫键在肽链间或肽链内的位置。,二硫键位置的确定,3.蛋白质一级结构举例（1）胰岛素（Insulin）,A链,B链,一个链内二硫键和两个链间二硫键，分子量5700,A链21个aa残基,B链30个aa残基,（2）牛胰核糖核酸酶（RNase）一条多肽链，124AA残基组成，四个链内二硫键，分子量12600。它是测出一级结构的第一个酶分子。,四蛋白质一级结构与生物功能的关系（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化1、同源蛋白质在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，称为序列同源性。具有明显序列同源的蛋白质也称为同源蛋白质。同源蛋白质含有不变残基和可变残基。2、细胞色素C细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。,血红素结合部位,酶结合部位,通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明：（1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大。不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目黑猩猩0鸡、火鸡13牛猪羊10海龟15狗驴11小麦35粗糙链孢霉43酵母菌44（2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变（不变残基）,（二）同源蛋白质具有共同的进化起源,1、氧合血红素蛋白肌红蛋白、血红蛋白的链和链是珠蛋白，它们有很高的序列同源。人肌红蛋白和人-珠蛋白链有38个氨基酸是相同的，人-珠蛋白和人-珠蛋白有64个残基是共同的。,20世