IL-1β对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白作用及机制

第46卷第3期青岛大学医学院学报2010年6月ACTAACADEMIAEMEDICINAEQINGDAOUNIVERSITATISVO146，NO3JUNE2010DOI103969JISSN16724488201003013IL一1L3对成纤维细胞合成工型胶原蛋白作用及机制李学森，褚言琛青岛大学医学院附属医院，山东青岛，邹云雯。王志杰2660031脊柱外科；2创伤外科摘要目的研究白细胞介素1BIL一113对成纤维细胞合成I型胶原蛋白的作用及机制，以探讨ILI对硬膜外瘢痕形成的影响。方法将NIH3T3细胞随机分为ILLP组、IL一1TSB202190P38MAPK特异性阻断剂组和对照组，各组经无血清培养2OH后，ILI组加入10UGL的IL一1P，IL一1PSB202190组用10LMOLL的SB202190预作用1H后加入10GL的ILI，对照组直接加体积分数002的血清。各组培养24H后收集细胞，采用RTPCR法检测I型胶原A2基因COL1A2MRNA的表达，WESTERNBLOTTING法检测COL1A2蛋白的表达。结果IL一18组COL1A2MRNA和COL1A2蛋白表达均明显低于II，L8SB202190组和对照组，差异有显著性F一5567、25101，Q一11882879，P005。结论IL一1B可能通过抑制NIH3T3细胞COLIA2的合成而抑制硬膜外瘢痕的形成，P38信号通路在ILI抑制瘢痕形成过程中起到重要的作用。关键词白细胞介素1；P38信号通路；硬膜外隙；瘢痕；成纤维细胞；胶原蛋白中图分类号R6196文献标志码A文章编号16724488201003022903MECHANISMOFINTERLEUKINLPAFFECTINGTYPEICOLLAGENSYNTHESISBYFIBROBLASTLIXUESEN，CHUYANCHEN，ZOUYUNWEN，ETALDEPARTMENTOFORTHOPAEDICS，THEAFFILIATEDHOSPITALOFQINGDAOUNIVERSITYMEDICALCOLLEGE，QINGDAO266003，CHINAEABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHEROLEANDMECHANISMOFINTERLEUKIN117INTHESYNTHESISOFTYPEICOLLAGENBYFIBROBLASTSOASTOEXPLORETHEIMPACTOFINTERLEUKIN117ONTHEFORMATIONOFEPIDURALSCARMETHODSTHENIH3T3CELLSWEREDIVIDEDINTOTHREEGROUPSIL，1BGROUP，IL117SB202190SPECIFICP38MAPKBLOCKERGROUPANDCONTROLGROUPAFTERSERUMFREECULTURINGFOR20HOURS，10UGLOFIL117WASADDEDTOIL117GROUPTHEIL117SB202190GROUPWASTREATEDWITHSB20219010UMOLLFOR1HOURBEFOREADDINGIL一11710UGL，ANDTHECONTROLGROUPRECEIVEDSAMEVOLUMEOF2SERUMAFTERCULTURINGFORANOTHER24HOURS，CEILSWERECOLLECTED，ANDBOTHMRNAANDPROTEINEXPRESSIONSOFTYPEICOLLAGENA2COL1A2DETECTEDWITHRTPCRANDWESTERNBLOTTING，RESPECTIVELYRESULTSTHEMRNAANDPROTEINEXPRESSIONSOFCOL1A2INIL一117GROUPWERESIGNIFICANTLYLOWERTHANTHATOFTHEIL一117SB202190GROUPANDTHECONTROLGROUPF5567，25L01；Q一11882879；P005CONCLUSIONILI17MIGHTINHIBITTHEFORMATIONOFEPIDURALSCARBYINHIBITINGTHEEXPRESSIONOFCOL1A2INNIH3T3CELLS，ANDP38SIGNALINGPATHWAYMAYPLAYANIMPORTANTROLEINTHEPROCESSOFSCARFORMATIONEKEYWORDSINTERLEUKIN1；P38MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASE；CICATRIX；EPIDURALSPACE；FIBROBLASTS；COLLAGEN硬膜外瘢痕是腰椎手术失败综合征FBSS的重要原因之一，约占FBSS的52413。对硬膜外瘢痕的防治长期以来缺少有效措施，而目前最前沿的细胞因子疗法对瘢痕的治疗取得了较好效果3。白细胞介素LTIL一18是一类重要的前炎症因子，在体内的组织损伤修复过程中起到重要的作用。P38MAPK信号通路是目前丝裂原激活的蛋白激酶MAPK通路中的一个重要成员，参与细胞对许多外界刺激的调节反应5。本研究应用IL1J3收稿日期基金项目作者简介通讯作者20100112；修订日期20100218青岛市科技局资助项目KZJ一30李学森1982一，男，在读硕士研究生。邹云雯1954一，男，主任医师，硕士生导师。以及P38MAPK的特异性阻断剂SB202190作用NIH3T3细胞，从胶原基因的转录水平调控及蛋白水平调控来研究IL一1B在纤维化过程中的作用及其机制，以期为硬膜外瘢痕的防治提供理论依据。现将结果报告如下。1材料与方法11实验试剂NIH3T3小鼠胚成纤维细胞中国科学院上海细胞库，胎牛血清杭州四季青公司，DMEM高糖培养基和25GL胰蛋白酶GIBCO公司，小鼠IL一1I3PEPROTECH公司，P38MAPK特异性阻断剂SB202190SIGMA公司，RIPA裂解液碧云天生物青岛大学医学院学报46卷技术有限公司，以工型胶原A2基因COLIA2兔多克隆抗体和13AETIN鼠单克隆抗体SANTACRUZ公司为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IGG和山羊抗兔IGGSANTACRUZS公司为二抗，TRIZOLRNA提取液和RTPCR试剂盒大连宝生物工程有限公司，小鼠COL1A2MRNA及内参照GAPDH的PCR引物JZ海生工生物工程技术服务有限公司，化学发光剂北京全式金生物技术有限公司，4上样缓冲液SOLARBIO公司。12实验分组与处理NIH3T3细胞在含体积分数010胎牛血清的DMEM高糖培养基中常规培养，选择对数生长期的NIH3T3细胞，用25GL的胰酶消化成单细胞悬液，按约05X10L的密度以均等的细胞数分别分装到3个25CM。培养瓶中，于37、体积分数005CO培养箱中培养，待融合达7O8O9，6时，随机分为IL113组、SB202190ILIT组及对照组，各组经无血清DMEM培养20H后，更换培养液。IL一1口组加入浓度10TGL的IL一1P；IL一1SB202190组用LOMOLL的SB20219O预作用1H后更换培养液，加入浓度10TGL的IL一1J3；对照组直接加含体积分数002胎牛血清的培养基。经上述换液后，继续培养24H，收集细胞。13检测指标及方法131COL1A2MRNA表达的检测应用逆转录一聚合酶链反应RTPCR法。细胞培养24H后，按照TRIZOL细胞裂解液说明提取细胞总RNA，所获样品总RNA的A260A280比值为1820。取2址G总RNA按照逆转录试剂盒说明书方法行逆转录反应，合成CDNA，随后进行PCR扩增。引物设计应用PRIMIER50软件，计算机完成。PCR引物序列小鼠COLIA2上游引物5，_CTCTGTCCTAGTCGATGGCTG、_3，下游引物5LACGGAATTCTTGGTCAGCACC一3，扩增片段长为142BP；GAPDH上游引物5，_GCATTGTGGAAGGGCTCA一3，下游引物5GGGTAGGAACACGGAAGG一3，扩增片段长207BP。扩增条件94预变性5MIN；然后94变性3OS、57退火30S、72延伸45S，共扩增35个循环；最后72延伸10MIN。PCR产物行溴乙锭染色的002GL琼脂糖凝胶电泳，用UVP凝胶分析系统扫描、分析电泳带的灰度，以COUA2扩增条带灰度与扩增GAPDH条带灰度之比表示COLIA2MRNA表达水平。132COL1A2蛋白表达的检测采用WESTERNBLOTTING法。细胞培养24H后，采用RIPA裂解液400LRIPA4LPMSF裂解细胞提取细胞总蛋白，取50G蛋白上样行100GLSDSPAGE电泳、转膜、封闭。分别使用COL1A2兔多克隆抗体1200和TACTIN鼠单克隆抗体1500孵育，室温轻摇2H后，4过夜，再用TBS洗涤3次每次10MIN，分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IGG15000和山羊抗小鼠IGG15000室温孵育120MIN，TBS洗涤3次每次15MIN后，最后X线片曝光、显影和定影后观察结果。14统计学处理应用SPSS130和PPMS157统计学软件进行数据处理，结果以TS表示，各组间比较应用方差分析。P005。见图1和表1。22各组C0LLA2蛋白表达的比较IL一1P组COL1A2蛋白表达明显低于IL一1PSB202190组和对照组，差异有显著性F一25101，Q一25862879，P005。见图2和表1。3讨论硬膜外瘢痕又称硬膜外纤维化，是指在硬膜外隙的手术涉及范围内形成的瘢痕或组织纤维化，是机体对创伤的修复反应，每例腰椎手术后病人都会发生。瘢痕的粘连收缩会牵拉硬膜和神经根，限制其活动；被瘢痕包绕的神经根受到非正常的牵拉和挤压，神经纤维的轴浆运输、动脉血供、静脉回流受影响，神经根和背侧神经节对机械压迫很敏感，会产生一系列症状，如疼痛、麻木、下肢肌力降低等。在纤维化疾病中，异常沉积在组织器官的细胞外基质以胶原为主，尤其是工型胶原等纤维性胶原，最终使组织器官硬化导致功能障碍或丧失，因此，对胶原的调控显得尤为重要。而最近有文献报道，IL3期李学森，褚言琛，邹云雯，等。IL一1口对成纤维细胞合成I型胶原蛋白作用及机制231400300200100MARKER对照组，IL一1P组，IL一1PSB202190组，、分别为、的GAPDH内参。图1RTPCR检测靶细胞中COL1A2MRNA的表达COLIA2一謦|_一对照组，IL一1P组，IL一1DSB202190组。图2WESTERNBLOTTING检测靶细胞COL1A2蛋白的表达表1各组细胞COL1A2MRNA和蛋白表达N8。士S1B可以抑制肌腱成纤维细胞胶原的表达_8，提示IL一1可能对瘢痕的形成有作用。然而，IL一1B对纤维化疾病作用的研究报道较少。本文通过观察IL一1L3对NIH3T3细胞COL1A2MRNA和蛋白表达的影响，来研究IL一1J3对瘢痕的作用。ILI是种具有多种生物活性的炎症细胞因子，能调节局部和系统的炎症反应，在组织损伤的修复过程中发挥着重要作用。而NIH3T3细胞是常被用作抗纤维化药物的筛选和机制研究的成纤维细胞系。本文的实验结果显示，一定浓度的IL一1G能够抑制成纤维细胞COL1A2的合成。而COLIA2合成的减少，在一定程度上可以使组织纤维化的机会减少。由此可以推测，IL一1P在纤维化疾病过程中通过抑制成纤维细胞胶原蛋白的合成，一定程度上可以减少胶原的异常沉积，从而抑制瘢痕的形成。然而，还有文献报道，IL一18能促进大鼠心肌成纤维细胞基质金属蛋白酶MMPS表达_8，而MMPS可以降解胶原蛋白等细胞外基质，在组织重构方面起重要的作用。所以，IL一18在抑制瘢痕形成方面是否有更强大的作用还有待进一步的研究。对于IL一18如何调节成纤维细胞胶原合成的研究报道尚少。目前，有文献报道，在P38通路IL一18调整大鼠心肌成纤维细胞MMPS表达中起重要作用9。而P38通路可被应激刺激紫外线、HO。、热休克和低氧等、炎性因子TNFA、II一1和IL6等及LPS和革兰阳性细菌细胞壁成分激活，参与炎症、应激等许多病理生理反应。本文的研究结果表明，应用P38MAPK激酶阻断剂SB202190浓度为10TOOLL处理细胞后，可明显减弱IL一1P对成纤维细胞COLIA2MRNA及蛋白表达的作用。说明P38通路在IL一1B抑制成纤维细胞COLIA2表达的过程中起了重要的作用。综上所述，IL一1B能抑制成纤维细胞I型胶原MRNA的表达和蛋白的合成，减少胶原的合成，使胶原异常沉积的机会减少，从而对瘢痕的形成起到一定的抑制作用。而P38信号通路作为重要信号转导途径之一，在预防瘢痕形成、调节纤维化的过程中发挥重要作用。参考文献E13COKLUKC，AYDIKEXPERIMENTALRABBITHEMILAMINOTOMYMODELINTHEEVALUATIONOFPERIDURALFIBROSISAMINIMALLYINVASIVEPERIDURALFIBROSISMODELJMINIMINVASIVENEUROSURG，2005，484235239，2MARIUSZM，MICHATT，PAWETI，ETA1ANATTEMPTTOUSEGORETEXSURGICALMEMBRANEINLUMBARDISCSURGERYJJNEUROLOGIAINEUROCHIRURGIAPOLSKA，2004，3842712773ONOI，YAMASHITAT，HIDAT，ETA1LOCALADMINISTRATIONOFHEPATOCYTEGROWTHFACTORGENEENHANCESTHEREGENERATIONOFDERMISINACUTEINCISIONALWOUNDSJJSURGRES，2004，120147554任丽虹，郝立君，肖志波，等结缔组织生长因子反义寡核苷酸对人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子表达及胶原合成的作用J中国临床康复，2006，LO1692955NGUYEN，GOGUSEV，KNAPNOUGEL，ETA1PROTEINTYROSINEKII