霉菌和毒素的检测方法

,食品中霉菌及毒素的检测方法,专业：食品科学,Number1,研究背景及意义,Number2,霉菌的检测方法,Number3,毒素的检测方法,Number4,参考文献,目录contents,霉菌,霉菌广泛分布于自然界中，由于其可形成各种微小的孢子，因而很容易污染食品。,霉菌毒素,霉菌毒素是霉菌产生的一种有毒的次生代谢产物，毒素污染会导致营养价值降低，引起动物疾病，并直接或间接危害人类健康。,1研究背景及意义,自从20世纪60年代发现强致癌的黄曲霉毒素以来,霉菌与霉菌毒素对食品的污染日益引起重视。我国在2011年颁布了国家标准GB2761-2011食品中真菌毒素限量,各级食品监督检测机构全面开展霉菌的检测工作。,方法,01,GB4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数。,方法,02,食品中霉菌和酵母计数PetrifilmTM测试片法。,2.1霉菌检测方法,03,菌落计数,结果和报告,04,05,镜检,培养,02,01,样品的稀释,2.1食品微生物学检验霉菌和酵母计数,2.1.1样品的稀释,2.1.2培养,肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）表示。选取菌落数在10CFU150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。,2.1.3菌落计数,2.1.4.1结果,计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。,2.1.4.2报告,1)菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。2)菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。3)称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。,2.1.5镜检,B.1检样的制备：取定量检样,加蒸馏水稀释至折光指数为1.34471.3460（即浓度为7.9%8.8%），备用。B.2显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。B.3涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。B.4观测：将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样观察50个视野，同一检样应由两人进行观察。B.5结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野（1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测微器的一格）时即为阳性（+），否则为阴性（-），按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。,2.1食品中霉菌和酵母计数PetrifilmTM测试片法,PetrifilmTM霉菌和酵母测试片：1）测试片中添加抗生素，可抑制细菌生长；2）含有酵母菌指示剂，使酵母菌更易计数；3）适用与菌落总数、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特氏菌。,酶菌毒素,Text1,酶联免疫吸附法,Text2,荧光检测法,Text3,近红外光谱法,Text4,微柱法,Text5,薄层色谱法.,Text6,气相色谱和气质谱联用法,Text7,高效液相色谱法和液质联用,2.2霉菌毒素检测方法,ELISA是利用抗原抗体反应原理，已知抗原吸附在酶标板上加入酶标记抗体和样品提取液并混合均匀，充分反应后用去离子水洗去多余抗体，再加入酶的底物，产生有色物质，最后加入终止液使反应终止。柳其芳2006ELISA法操作简单、检测速度快、成本低，适用于大批量样品的快速筛选。蒋建云2006等也用此法检测饲料中黄曲霉毒素B1的含量，不但特异性强提取纯化步骤简单，结果也易判读回收率在90%左右。,2.2.1酶联免疫吸附法,2.2.2荧光检测法,荧光检测法FLD常结合免疫亲和柱使用，是美国AOAC的标准检测方法，我国国标(GB/T18979-2003)也采用此法检测黄曲霉毒素的含量，检测样品经甲醇/水提取后、过滤、稀释。用含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱层析净化，超纯水洗去杂质，甲醇洗脱，加入溴溶液衍生后用荧光光度计测定。赵东豪等2009此法也常用来检测玉米赤霉烯酮等。荧光检测法方便、快捷、花费少、不需使用霉菌毒素的标准品，减少对人的伤害也常作为快速筛选方法使用。,2.2.3近红外光谱法,近红外光谱法（NIR）是近年来发展得比较快的光谱分析技术。NIR可以用来检测小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇等霉菌毒素。使用NIR分析，样品不需预处理，多种组分可以同时测定，分析速度快，重现性好，但是此方法必须先建立准确的校正模型，适用于经常性质量控制分析。,2.2.4微柱法,微柱法：将样品提取液通过氧化铝-硅镁型吸附剂填充的微柱，样品中的杂质被氧化铝吸附，霉菌毒素则被硅镁型吸附剂吸附，在紫外分析灯下观察荧光环与标准比较定量本法简便快速、灵敏度高。主要用于饲料中黄曲霉毒素的筛选。,微柱凝胶免疫监测仪,2.2.5薄层色谱法,薄层色谱法：将样品提取液在薄层板上点样，展开后，用吸收法或荧光法对被测样品与标准品扫描测定。对于黄曲霉毒素B1的检测，我国国标采用(TLC)法，该方法更适于确认黄曲霉毒素存在与否。,气相色谱和气质联用法,2.2.5气相色谱和气质联用法,气相色谱和气相色谱-质谱联用法20世纪70年代，气相色谱和气相色谱-质谱联用法开始用于霉菌毒素的检测毒素等单端孢霉烯族毒素。常采用气相色谱法检测，食品中毒素的检测，由于未知成分较多，一般采用与质谱联用，灵敏度也有较大的提高，检测限更低。,高效液相色谱法较早用于霉菌毒素的检测常用的检测器有荧光、紫外、二极管阵列、蒸发光散射等检测器，目前使用最广泛的检测霉菌毒素的方法涉及到畜牧化工和食品等各行业。,2.5.6.高效液相色谱和液质联用,液相色谱,液-质联用,HPLC-MS具有灵敏度高、特异性强、精确度和选择性好等特点，能够对霉菌毒素进行准确的定性分析，不但检测霉菌毒素还可以检测结构类似的其他物质,但是仪器设备比较昂贵检测成本高操作步骤复杂因此目前国内的普及率不高。,2.5.6高效液相色谱和液质联用,4参考文献,1龚阿琼，胡骏鹏.常见霉菌毒素的危害及检测方法J,2014;2施震地.食品中霉菌检测方法探究J，2012；3GB4789.15-2010食品微生