制备抗氧化大豆肽用酶的筛选

制备抗氧化大豆肽用酶的筛选黄纪念1，豆康宁2，郑学龄2（1河南省农科院农副产品加工研究所，郑州450002；2河南工业大学粮油食品学院，郑州450052）摘要本文研究了由碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白酶制备的大豆肽的抗氧化值大小，结果表明，大豆肽的氧化值大小与酶的种类和水解度的大小有关，以抗氧化值大小为指标，筛选出碱性酶为最佳用酶。关键字大豆肽；蛋白酶；水解度；抗氧化值近年来研究发现，大豆肽在体外具有抗氧化活性。CHEN等1发现大豆蛋白酶解物具有抗亚油酸脂质过氧化作用；张学忠等2发现在邻苯三酚自氧化反应体系中添加40MG/ML大豆多肽，邻苯三酚自氧化速率被抑制27，这说明大豆蛋白酶解物具有清除超氧阴离子作用；陈美珍等3研究发现大豆分离蛋白酶解物具有清除羟自由基的能力，其清除能力主要与暴露的氨基酸侧链基团和肽序列有关。抗氧化大豆肽在保健食品方面应用前景广阔，开展制备抗氧化大豆肽用酶的筛选研究具有重要的理论价值和应用前景。1材料与方法11材料与试剂大豆分离蛋白，由郑州同创益生食品有限公司提供；碱性蛋白酶（24AU/G）、风味复合酶（500LAPU/G）、复合酶（15AU/G），由NOVOZYME提供；木瓜蛋白酶（60万U/G），由广西南宁杰沃生物制品有限公司提供；菠萝蛋白酶（2500GDU），由广州丰天化工有限公司提供；胃蛋白酶（110000）、胰蛋白酶（250UFU/MG）、亚油酸（分析纯），由SIGMA提供；磷酸缓冲液（PH935）、FECL2EDTA溶液（005MOL/L）、FECL2溶液（01MOL/L）、KSCN（40）、乙醇（75，含03MOL/LHCL）、茚三酮显色试剂、甘氨酸溶液（含氮量5UG/ML）、1MOL/LNAOH溶液、2NHCL溶液等。12仪器紫外可见分光光度计，超声波清洗机，离心分离机，PH酸度计，凯氏定氮仪，增力电动搅拌器，电热恒温水浴锅，恒温干燥箱。13实验方法131氮含量测定凯式定氮（GB/T500952003）。132大豆肽溶液制备配制4（W/V）的大豆蛋白溶液，迅速加热至80，经80水浴保温热处理10MIN后冷却至酶最佳水解温度，保持温度和搅拌速度不变，同时用NAOH（HCL）标准溶液调节溶液PH值至酶解最佳PH值。按比例称取蛋白酶加到大豆蛋白溶液中，开始计时，在反应过程中及时加入NAOH（HCL）标准溶液维持PH值不变，到预定的反应时间提取一定体积的溶液，然后迅速升温到85灭酶活10MIN，冷却后，以5000R/MIN离心分离10MIN，取其上清液测定水解度和抗氧化值。133水解度测定4H（A10310）/（1401）A/14（MMOL/ML）HO47750312（MMOL/ML）DH（）H/HO23A（1）注H大豆肽溶液中NH2的浓度（MMOL/ML）HO蛋白质溶液肽键当量浓度（MMOL/ML）A大豆肽溶液氮浓度（UG/ML）134蛋白酶水解参数的确定影响蛋白酶水解速度和蛋白质水解度的参数主要有温度、PH值、底物浓度、酶浓度、时间。以水解度为指标，先用单因素试验确定参数的最佳值，然后用正交试验优化因素组合，从而确定蛋白酶水解参数。135大豆肽抗氧化值测定5大豆肽抗氧化值测定参考文献5，并作了适当修改在小锥形瓶内放入10ML亚油酸储备液，300ML005MOL/L的FECL2EDTA溶液，500UL大豆肽溶液，混匀在暗处50保存4H，然后取出1000UL，加入200U101MOL/L的FECL2溶液，再加入1000UL的40KSCN溶液，混匀后取出130UL放入干试管中，再加入6ML乙醇（75，含03MOL/LHCL），混匀后反应5MIN，再测定该混合液481NM下的吸光值。以未水解的大豆蛋白反应溶液的吸光值作为空白值，它的相对抗氧化值为1。相对抗氧化值未水解蛋白溶液的吸光值/大豆肽溶液吸光值2实验结果21含氮量标准曲线用分光光度计（580NM）测得不同浓度甘氨酸工作液的吸光值见图1。含氮量与吸光值的回归方程为Y13342X00133（2），回归系数为R20998。方程（2）的反函数为X0425Y00095（3），把方程（3）中的X值代入公式（1）中的A值得DH（）017Y（4）。22蛋白酶酶解参数的确定以水解度为指标，先用单因素试验确定参数的范围值（限于篇幅，具体数据略），然有用正交试验优化因素组合，7种蛋白酶的最佳参数组合见表1。表17种蛋白酶水解参数的最佳组合温度（）PH值底物浓度（）酶浓度（）时间（MIN）碱性酶608030560风味酶50704630复合酶45704620木瓜酶55755340菠萝酶65805630胃酶37254230胰酶5070533023大豆肽溶液的水解度231大豆肽溶液的吸光度值用分光光度计（580NM）测得不同蛋白酶水解的不同浓度大豆肽溶液的吸光度值见表2，未水解的蛋白质溶液吸光度值为0178。232大豆肽溶液的水解度把表2中的吸光度值代入公式（4）得到相应的大豆肽溶液水解度，结果见图2，其中未经蛋白酶水解的大豆蛋白溶液的水解度为303。由图2可知，7种蛋白酶水解大豆蛋白的程度随着水解时间（4H内）的延长而增大，但是水解速率开始较大，后来渐渐变的越来越小。其中碱性蛋白酶比其它6种蛋白酶的水解能力明显强。25大豆肽溶液的抗氧化值亚油酸缓冲液与大豆肽混合溶液经抗氧化实验后，用分光光度计在481NM下测吸光值，再计算大豆肽溶液的相对过氧化值，以相对过氧化值的大小来表示大豆肽的抗氧化能力，结果见图3。表2不同蛋白酶水解产物大豆肽溶液的吸光值吸光值1（1H）2（2H）3（3H）4（4H）碱性酶0605070509750985风味酶0545063208770909复合酶0487053205870627木瓜酶0340034903550412菠萝酶0422047407080808胃酶0231024302930299胰酶0462058305990603由图3可知，蛋白酶所水解的大豆肽溶液的抗氧化力随酶解时间（4H内）的延长，开始增加较快，后来增加缓慢，有的甚至停止。这7种酶中，碱性蛋白酶所水解的大豆肽溶液抗氧化值最大。3结论（1）大豆肽具有抗氧化性，不同的蛋白酶所制备的大豆肽其抗氧化能力也不相同。（2）在所研究的7种蛋白酶中碱性蛋白酶的水解能力最强和其所制备的大豆肽抗氧化值最大，应为最佳酶选。参考文献1CHENHM，MURAMOTOKY，AMAUCHIF，ETALANTIOXIDATIVEPROPERTIESOFHISTIDINECONTAININGPEPTIDESDESINNEDFROMPEPTIDEFRANGMENTSFOUNDINTHEDIGESTSOFASOYBEANPROTEINJAGRICFOODCHEM，1998，4649532张学忠大豆肽加工技术原理与应用北京科学技术文献出版社，19991812003陈美珍大豆分离蛋自酶解物清除羟自由基用的研究食品科学，2002，23（1）；43474何照范，张迪清保健食品化学及其检测技术北京中国轻工业出版社5ADLERNISSENJENZY