维生素A诱导成纤维细胞内视黄酸受体γ基因的表达变化研究

TLLORICULTUHAEDOREGLISIHI华北农学报2009，24增刊1517维生素A诱导成纤维细胞内视黄酸受体基因的表达变化研究张冬杰，刘娣黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨150086摘要采用半定量RTPCR技术检测分析了在体外培养的猪成纤维细胞内分别添加终浓度为05，5，10，30TGGL的维生素A后，分别作用12，24，48和72H后，视黄酸受体7基因RAR7的表达变化情况。结果表明，不同浓度组间差异不显著，但是分别作用24和72H后，会出现抑制RAR7基因表达的现象。关键词猪；视黄酸受体7基因；成纤维细胞；RTPCR中图分类号Q786文献标识码A文章编号100070912009增刊一001503RETINOICACIDRECEPTOR丫EXPRESSIONISINDUCEDINFIBROBLASTCELLBYVITAMINAZHANGDONGJIE，LIUDIHEILONGJIANGACADEMYOFAGRICULTURESCIENCES，HARBIN150086，CHINAABSTRACTINTHEPRESENTSTUDY，RAR7EXPRESSIONWASDETERMINEDBYRTPCRINFIBROBLASTCELLSCULTUREDINADDITIONAL05，5，10，30GLVITAMINAMEDIAANDCULTURED12，24，48AND72HRESPECTIVELYTHERESULTSSHOWEDTHATDIFFERENTCONCENTRATIONHADNODIFFERENCE，BUTAFTERAFFECTED24AND72HRESPECTIVELY，ITWOULDAPPEARINGINHIBITIONPHENOMENANKEYWORDSPIG；RETINOICACIDRECEPTOR7；FIBROBLASTCELL；RTPCR视黄酸RETINOICACID，RA是一种脂溶性的小分子物质300KDA，属于VITA的衍生物一类维生素，是细胞分化和组织形态发生的主要调节因子，在上皮细胞的生长、细胞分化、视觉、组织维持、胎儿发育和繁殖等过程中发挥着重要作用。RA的这种多效性被认为是由属于配基诱导转录调节因子超家族的两类受体家族介导的。这两种RA受体家族即BARRETINOICACIDRECEPTOR和RXRRETINOIDXRECEPTOR，都是类固醇甲状腺受体基因超家族的成员，都有三种亚型A、J3、，在不同组织发育阶段不同程度地表达，RA作用的发挥要借助于这些RARS和RXRS反式作用因子的调节UJ。RAR受体家族的第3个受体是视黄酸受体基因RETINOIEACIDRECEPTOR，RATR，最先在鼠中发现，主要在皮肤中检测到它的RNA。KRUST等用鼠的CDNA克隆了人的相似基因，氨基酸序列比较分析发现，RARA，脚和RAR7在种间的保守性要远高于同一物种内3个受体的保守性，这一研究结果说明，RAR的3个亚型可能行使着不同的功能。RARR在人和鼠的皮肤中都是优势表达的RAR3J。本研究以体外培养的猪耳皮成纤维细胞为试验材料，采用半定量RTPCR方法检测和分析了不同浓度的维生素A以及不同作用时间对RA研基因的表达影响。1材料和方法11成纤维细胞体外培养在超净台上，用PBS液将所取的耳组织块漂洗35次，剪成1胁3左右的小块，加入微量的含20胎牛血清的DMEMF12GIBCO培养液，于39饱和湿度CO2培养箱中培养5H左右，补加培养液，之后隔天换液1次。待细胞基本汇合后，吸去培养液，PBS清洗，加2ML消化液消化23MIN，终止消化后，L000RRAIN离心5MIN，制成细胞悬液，接种于直径60RAIN的培养皿中培养，每2D更换1次培养收稿日期200903一L8基金项目黑龙江省博士后基金LRB07392作者简介张冬杰1980一，女，黑龙江哈尔滨人，助理研究员，博士，主要从事猪的分子遗传育种研究。通讯作者刘娣1963一，女，吉林长春人，博士，教授，博士生导师，主要从事动物遗传育种与繁殖的研究。CT11ORICULIURAEDOREJILISIHI曲16华北农学报24卷液。传至第3代时，加入维生素ASIGMA，使其终浓度分别为05，5，L0，30G，待生长到12，24，48和72H时，分浓度收获细胞，每组设1个阴性对照。12RTPCR检测RARY121总RNA抽提使用TRIZOL试剂盒INVITROGEN提取制备总RNA，一8O保存。122引物设计根据GENBANK上已提交的RAREU82629和PACTIN基因内标基因U07786的序列设计引物，引物序列如下F1GGGCAAATACACCACGAA，R1CAGCAAAGGCAAAGACGAG；F2CGGGACCTGACCGACATCCA，R2GGGCCGTGATCTCCTRCTG。引物由上海英骏公司合成。123RTPCR使用BCABESTTMRNA试剂盒TAKARA将所提取的总RNA反转录成CDNA，并以此CDNA为模板进行PCR扩增。因为退火温度不同，所以兄4肘和ACTIN基因的PCR扩增均在单管中进行。每样品做2次重复，同时用DDH2O分别取MBP代RNA样品和RT产物作为对照，以检验是否有基因组和外源DNA污染，并用混合样品待测样品等比例混合来建立最佳反应条件处于指数增长期的循环参数和校正不同批次间的差异。13结果分析与显著性检验采用BIORAD公司生产的凝胶电泳成像系统自带的分析软件QUANTITYONE对电泳凝胶中的PCR产物条带进行定量分析，结果用SAS612进行显著性检验。2结果与分析21RARY和PACAN基因最佳反应条件的确定PCR扩增RAR和FLACTIN基因时，起始循环数分别从26和21开始，模板为1TTL50NG，每隔1个循环将反应管拿出1管，直至循环结束。PCR反应后进行电泳，分析IOD值，发现PCR扩增产量呈规律的直线性增加图1，2。500蓍奏2000图1RARE基因的PCR循环数与产量的关系FIG1RELATIONSHIPBETWEENPCRCYCLINGNUMBERANDPRODUCTSOFRARE,嚣2000獬10007505O0250100OO000000000OO0000000O0212223242526272B2930循环数图2PACTN基因的PCR循环数与产量的关系FIG2RELATIONSHIPBETWEENPCRCYCUNGNUMBERANDPRODUCTSOFPACTIN22维生素A对RAR7基因表达变化的影响结果素A后，RAIO“基因的表达变化见图3。分别添加终浓度为05，5，10，30GL的维生RARPAETIN10ZGZL；205GL；35G；410G,UL；530L图3RARY基因表达变化情况FIG3EXPRESSIONOFRAR7GENE从该图可以看出，不同浓度组间对RAR“基因用24H和72H后，维生素A显著抑制了P,AR7基因的表达影响差异不显著，但是不同的作用时间下的表达，而在12H和48H的时候，这种抑制作用消RAR基因的表达存在显著差异尸005。分别作失，试验组与对照组表达水平一致，统计结果见表4。增刊张冬杰等维生素A诱导成纤维细胞内视黄酸受体7基因的表达变化研究17表4添加不同浓度RA时的方差分析TAB4ANOVAANALYSISOFDIFFERENTCONCENTRATIONOFRACTABRICULTURAEDOREIILI1111注同一行字母不同表示差异显著P0O5。NOTETHEDIFFERENTLETTERSINDICATESIGNIFICANCEAS005LEVEL3讨论关于维生素A维甲酸对RAR7基因作用效果的研究报道，虽然不如肠和基因多，但是在人和鼠的不同细胞系内还是进行过多次研究报道。比如HU等认为在F9畸胎癌干细胞中添加维甲酸不能改变CAR的MRNA水平；CLIFFORD等J在研究鼠的91一C2黑素瘤细胞后发现，添加10一和L0MOLL的J3全反式维甲酸24H后，的MRNA增加152倍，但如果是低浓度的维甲酸则不起作用；CROWE等J认为在人的角质化细胞中，RARE表达稳定持续，而且基本不受维甲酸的影响；而2007年DVORAKL6J发现，在鼠的肝细胞中1TMOLL的全反式视黄酸负调节RARZ降低41。本试验的研究结果表明，不同浓度的维甲酸对RARZ基因的表达变化无影响，而不同作用时间的影响效果则不同，在维甲酸作用24，72H后，会出现抑制RAR基因表达的现象。综合本试验结果，同时参考前人的研究结果后发现，维甲酸对RAR7基因的作用效果是多样的。推测产生这一结果的原因可能是因为不同组织内维甲酸的靶受体基因不同造成的。参考文献1周国利，朱奇，郭彦，等视黄酸受体7基因的研究进展J聊城大学学报自然科学版，2004，17456602KRUSTA，KASTNERP，PETKOVICHM，ETAATHIRDHUMANRETINOICACIDRECEPTOR，HRARGAMMAJJPROCNAILACADSCIUSA，1989，8614531053143HUL，GUDASLJCYCHCAMPANALOGSANDRETINOIEACIDINFLUENCETHEEXPRESSIONOFRETINOIEACIDRECEPTORALPHA，BETA，ANDGAMMAMRNASINF9TCRATOCAREINOMACELLSJMOLCELLBIOL，1990，1013913964CLI舫RDJL，PETKOVICHM，CHAMBONP，ETA1MODULATIONBYRETINOIDSOFMRNALEVELSFORNUCLEARRETINOICACIDRECEPTORSINMURINEMELANOMACEHSJMOLENDOERINOL，1990，41O154615555CMWEDL，HUL，GUDASLJ，ETA1VARIABLEEXPRESSIONOFREFINOICACIDRECEPTORRARBETAMRNAINHUMANORALANDEPIDERMALKERATINOEYTES；RELATIONTOKERATIN19EXPRESSIONANDKERATINIZATIONPOTENTIALJDIFFERENTIATION，199L，4831992086D