《质粒的酶切》PPT课件

质粒的酶切酶切片段的回收酶切片段的连接,亚克隆流程示意,关于限制性内切酶,1.定义：识别双链DNA分子核苷酸序列并加以切开2.来源：细菌的限制修饰系统3.特性：识别46个核苷酸序列产生平端和粘端4.应用：定点切割,酶切产生的末端,（1）GATATCCTATAGEcoR酶切产生平端GATPATCCTAPTAG（2）GAATTCCTTAAGEcoR酶切产生5突出粘端GPAATTCCTTAAPG(3）CTGCAGGACGTCPst酶切产生3突出粘端CTGCAPGGPACGTC,限制性内切酶的定义、命名,1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：Hind前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“”表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichiacoliRIHindHaemophilusinfluensaedSacI(II)StreptomycesachromagenesI(),酶切反应,限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。20l体积反应体系如下：A:质粒（pGEM-1808或pET21a）0.5gB:10酶切buffer2.0lC:Hind0.5lD:EcoR0.5lE:加ddH2O至20l37水浴消化1小时。,酶切示意图,EcoR,EcoR,EcoR,EcoR,pGEM-NGF,NGF,NGF,酶切,pGEM载体,EcoR,EcoR,质粒的酶切电泳,琼脂糖冻融法回收、纯化DNA片段,1.在紫外灯下仔细切下含所需DNA片段的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中。2.加入等体积的Tris-Cl饱和酚（pH7.6），振荡混匀；-20放置5-10min待结冻；3.10000rpm5min，上层液转移置另一离心管中；4.原管加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；-20放置5-10min待结冻；5.10000rpm5min，合并上清液；6.用等体积酚/氯仿抽提2次、氯仿抽提1次，取上清于新微量离心管；7.加入1/10体积3MNaAc（pH5.2），2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20，放置30min（或过夜）；8.13000rpm10min，弃上清；75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；9.适量H2O或TE溶解；电泳检测。,关于连接酶,定义：ATP存在下，在3OH和5P之间形成磷酸二酯键。特性：连接粘端的效率远高于平端。策略：1.首选不匹配粘端2.次选匹配粘端，载体脱磷3.平端连接，提高酶量,不匹配粘端连接图示,匹配粘端连接图示,平端连接图示,DNA片段的连接反应,连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行1.10l体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为11-15），补ddH2O至8l。2.轻轻混匀，稍加离心，置565min，迅速转入冰浴。4.加入含ATP的10Buffer1l。5.T4DNA连接酶1l。6.稍加离心,14-16