免疫学检测技术

免疫学检测技术,抗原或抗体检测原理： 借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。,抗原和抗体可以发生高度专一性的结合,抗原或抗体检测原理,一种细菌可以刺激多少种抗体产生？,根据抗原的化学性质分：天然抗原：微生物及其产物抗原如菌体抗原（O 抗原） 鞭毛抗原（H 抗原）表面抗原（如大肠杆菌的K 抗原）细菌的毒素抗原病毒抗原（V 抗原）人工抗原：人工合成多肽、蛋白等,抗体（Antibody),注射,抗原（如类毒素）,血清,抗体？抗原？,抗体的制备,一、凝聚反应(Agglutination) 二、沉淀反应 1、溶液中的沉淀反应 2、凝胶扩散沉淀 3、免疫电泳 血清免疫电泳 火箭电泳 对流免疫电泳 三、补体参与的反应 四、免疫标记的抗原抗体技术 酶联免疫吸附（ELISA）,抗原抗体检测方法,一、凝集反应,凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。,一、凝集反应,二、沉淀反应,当抗原是可溶性分子时，与抗体结合则形成沉淀。1、絮状沉淀反应 一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在中性条件下37度保温1-2h，便可见到絮状的蛋白质沉淀。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例，检测抗原抗体的分子比。2、环状沉淀反应 在试管中加入抗体后，小心加入相应抗原，使抗原抗体步混合，37度保温10-20min，在二者界面上出现环状沉淀。不能用于定量测定。,3、双向扩散：又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。 琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体相遇，比例合适时形成沉淀。可观测到沉淀弧。 沉淀弧的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系时，会出现多条沉淀弧。,二、沉淀反应,双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼脂，取4mL倒在普通载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。,二、沉淀反应,抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧的特征不同： 抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧有多条，彼此互不干扰。,4、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的是在琼脂中含有一定量的抗体，孔内加入未知量的相应抗原。在37度保温过程中，孔内的抗原向周围扩散，与抗体形成沉淀圈。根据沉淀圈的大小确定抗原的含量,二、沉淀反应,二、沉淀反应,另外还有其他众多的免疫检测技术和手段，其机理都利用了抗原抗体的沉淀反应。 例如微量免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳等。,免疫电泳,抗原或抗体检测的现代方法：,1. 免疫荧光技术2. 酶联免疫分析法3. 放射免疫分析法,免疫荧光技术,将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC)和罗丹明（rhodamine B200,RB200)等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸的氨基结合，在蓝紫光激发下，可分别出现鲜明的黄绿色及玫瑰红色。,1、基本原理： 将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。,免疫荧光技术,1、基本原理：免疫荧光素技术,免疫荧光技术,2、标本的制作 食品卫生检验中，荧光标记抗体检测标本的制作方法是将样品增菌液涂在载玻片上，涂片应薄而均匀，干燥后用化学方法固定，然后进行荧光染色。,免疫荧光技术, 染色当天即作镜检 通风良好的暗室内进行 选择好光源或滤光片,免疫荧光技术,ELISA 基本原理 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。,酶联免疫吸附剂测定,ELISA 基本原理 在测定时，把受检酶标抗体或抗原和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。,酶联免疫吸附剂测定,ELISA 基本原理,碱性磷酸酶或过氧化物酶,酶联免疫吸附剂测定,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。,酶联免疫吸附剂测定,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体： （4）加底物：,酶联免疫吸附剂测定,双抗体夹心法测定抗原,ELISA测定方法 1、 加样 2、 保温 3、 洗涤 4、 比色 5、 结果判定,封闭 P330 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的操作与包被相类似。 最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，可以高浓度使用（5%）。,采用酶标法（ELISA）进行三聚氰胺检测,Thermo MK3型酶标仪,酶标仪原理与结构,ELISA法检测肠毒素,胶体金试纸条诊断技术,一、简 介,胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等检测。,一、简 介,胶体金（Colloidal gold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。,一、简 介,胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合。胶体金标记技术（Immunogold labeling technique）是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术,二、胶体金试纸条诊断技术的原理,以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体。,胶体金试纸条示意图,测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。,测 定,测 定,过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。,测 定,阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。,胶体金快速诊断技术的特点,简捷快速：操作简单，一般只要5-10min 就会出结果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR 需要时间更长。结果易于判定：阴、阳性呈色很明