《维生素的测定》PPT课件

第十三章维生素的测定一、概述定义维生素既不是构成机体组织的基本原料，也不是机体的供能物质，它是一类需求量极少、人体不能合成（或合成量很少）、主要以辅酶的形式参与代谢调节，是维持人体正常生命活动所必需的天然有机化合物。目前已确认的有30余种，其中被认为至关重要的有20余种。,维生素的命名1、多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生素A、维生素B1、B2，维生素C，维生素E等。2、也有根据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸、生育酚等，3、按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、烟酸、叶酸等。,维生素的分类,1、脂溶性维生素：能溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K各小类，其共同特点是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒。由于可储藏在脂肪中，故不需每天供给。2、水溶性维生素：能溶于水，包括B、C各小类，其共同特点是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都能从机体排出，需要每天供给。,VA1,7脱氢胆固醇,麦角固醇,生育三烯酚,生育酚,胡萝卜素,VA2,维生素D3(胆钙化醇),测定食品中维生素的含量的意义,1、在评价食品的营养价值，2、寻找富含维生素的食品资源，3指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生素中毒，4、研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的工艺及贮存条件，5、监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引起维生素中毒,维生素的分析方法,生物鉴定法：费时、费力、需要动物饲养场地微生物法：仅限于水溶性维生素的测定荧光法：用于硫胺素的测定仪器法：快速、灵敏、有较好的选择性HPLC：用于大多数维生素的测定，费用高,二、脂溶性维生素的测定,脂溶性维生素的理化性质溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于苯、乙醚、丙酮、三氯甲烷、乙醇等有机溶剂。耐酸碱性：维生素A、D对酸（ACID）不稳定，对碱稳定；维生素E在无氧情况下，对热、酸、碱稳定。维生素K对酸、碱都不稳定。耐热、耐光、耐氧化性：维生素A、D、E、K耐热性都好，维生素D性质稳定，不易被氧化。,维生素A易被氧化，光和热会促进其氧化。维生素E容易被氧化，对可见光稳定但易被紫外线破坏。维生素K对热稳定，但容易被光、氧化剂及醇破坏。（这样在提取时，要求尽量避光、并加入抗氧化剂）,GlobalExtractionTechforLiposolubleVitamins,Weighproperamountofthefoodsubstanceandtransfertoa150mlroundflask,RedissolvetheresiduewithaknowvolumeofhexaneforHPLCanalysis,Evaporatetodryinavacuumatatemperatureof35degreeC,Removeandfiltertheorganicphasethroughanhydroussodiumphases,Waittoobtaincompleteseparationofthetwophases,Add10mlof33%KOHand40mlethanol,Boilatrefluxfor30mins,Coolveryrapidly,thenadd17mlof25%HCl,andcoolagain,Add50mlofpetroleumetherandshakevigorouslyfor3mins,脂溶性维生素提取的一般步骤及注意事项步骤：1、取样（如鱼肝）2、加乙醇研磨或匀浆机均质化（常加入抗氧化剂（如焦性没食子酸，抗坏血酸等）3、加碱加热皂化（Vk除外）（使脂肪水解成脂肪酸进而形成水溶性的脂肪酸盐）4、水洗去除脂肪酸盐5、从水洗后的残渣中用有机溶剂提取脂溶性维生素6、必要时进行减压回旋蒸发浓缩7、HPLC分析,注意事项：1、在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，加入抗氧化剂2、对于某些含脂肪量低、脂溶性维生素含量较高的样品，可以先用有机溶剂抽提，然后皂化，再提取。3、对于那些对光敏感的维生素，分析操作一般需要在避光条件下进行。,一.高效液相色谱法（HPLC）测定食物中维生素A、E的含量,（一）原理样品中维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器，用内标法定量测定,（二）样品处理1.皂化称取适量样品（含维生素A约3g，维生素E各异构体约40g）于三角瓶中，加30mL无水乙醇，振摇使样品分散。加入5mL100g/L抗坏血酸溶液和2.00mL苯并e芘溶液（5g/L，内标用），混匀，加10mL氢氧化钾溶液（50浓度），混匀，于沸水浴上回流30min，使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷却。,2.提取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分23次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL无水乙醚分2次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。然后每次用约100mL水将乙醚液洗至中性，约45次,3.浓缩将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g）滤入150mL旋转蒸发瓶内，用约15mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，于55水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下约2mL时，取下蒸发瓶，用氮气吹干乙醚，随即加入2mL乙醇，充分混合、溶解提取物。将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上离心5min（3000r/min），上清液供色谱分析用。,（三）液相色谱分析色谱推荐条件：预柱：ODS10m,4mm4.5cm分析柱：ODS5m,4.6mm25cm流动相：甲醇：水98：2，混匀，临用前脱气。紫外检测器波长：300nm,量程0.02进样量：20L流速：1.651.70mL/min,(四)计算X=/mV100/1000式中X-某种维生素的含量，mg/100g;-由标准曲线上查到某种维生素含量，g/mL；V样品浓缩定容体积，mL；m样品质量，g。,二、比色法测定维生素A的含量,（一）原理维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比，在620nm波长下测定其吸光度。,（二）测定方法1样品处理维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。,称取0.55g样品于锥形瓶中，加入10mL50氢氧化钾溶液及2040mL乙醇，于电热板上回流30min，至皂化完全。将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，用无水乙醚充分洗涤皂化瓶，洗液并入分液漏斗内，将水层与乙醚层分开，水层反复用乙醚抽提直至无维生素A为止。合并醚层后，先用水洗提后，再用0.5mol/L氢氧化钾溶液洗涤除去醚溶性酸皂，再用水洗涤醚层，直至洗涤水不呈碱性（用酚酞指示剂）为止。将醚层放出，经过无水硫酸钠脱水后，蒸馏浓缩至剩下5mL乙醚时减压抽气至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜范围内，供比色测定。,2标准曲线制备准确取一定量维生素A标准溶液于45个容量瓶内，用三氯甲烷配置标准系列。再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成标准系列，于620nm波长处，以三氯甲烷调节零点，将标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入9ml三氯化锑三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度，绘制标准曲线。,3样品测定于一比色管中加10mL三氯甲烷，1滴乙酸酐为空白液，另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其它比色管分别加入1mL样品溶液及1滴乙酸酐，以下步骤同标准曲线的制备。,（三）计算x=/mv100/1000式中：x样品中维生素A含量，mg/100g（如按国际单位，1IU0.3ug维生素A）；由标准曲线上查得维生素A的含量，ug/mL；m样品质量，g；v抽取后加三氯甲烷定量的体积，mL；,（四）讨论1本法摘自GB1238890，适用于食品中维生素A的测定。2三氯化锑有腐蚀性，不能粘在手上，三氯化锑与水能生成白色沉淀，所以不能碰到水。3三氯化锑与维生素A生成的蓝色物质很不稳定，要在6s内完成吸光度的测定，否则蓝色反应逐渐消失，使结果偏低。,三、水溶性维生素的测定水溶性维生素:1、水溶性维生素包括维生素B族(维生素B1(硫胺素)、维生素B2（核黄素）、维生素B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）、维生素PP（烟酸）、叶酸、泛酸（维生素B3）、生物素（维生素B7）)维生素C(抗坏血酸)和硫辛酸，广泛存在于动植物组织中，常以辅酶的形式存在。,2、都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。3、在酸性介质中很稳定，即使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，如果同时加热，更易于破坏或分解。4它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响(如维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化)。,测定水溶性维生素的一般方法样品处理：一般多在酸性溶液中进行前处理，再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，再进行提取。为进一步去除杂质，还可用活性人造沸石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。测定水溶性维生素的方法常有高效液相色谱法、荧光比色法、比色法和微生物法等。,Techofextractingtheensembleofhydrosolublevitamins,homogenizethesampleaftercrushingitfinelyandrapidly(ifnecessary),Weigh5-10gsampleintoa250mlflaskandadd65ml0.1MHCl,Decantquantitativelyintoa100mlvolumetricflaskandadjustvolumewithwater,Add50mg-amylaseand50mgtakadiastase,incubateat37ovenforovernight,CoolandadjusttopH4.5with2.5MNaOAc,Heatat100degCfor30minsinawaterbath,Filterthesupernatantanddofurthertreatmenttothefiltrateifnecessary,HPLC,固定相:C18柱,或ODS柱流动相:甲醇-水=68:32固定相:硅胶柱流动相:氯仿:丙酮=55:45,PrincipleofNP-CandRP-C,Normalphasechromatography,Reversephasechromatography,键合的有机分子带有CN、NH3或(OH)2等极性基团的称为正相键合,一般用于分离非极性或极性较小物质；键合的有机分子带有十八烷基、辛烷基等非极性基团的称为反相键合,水溶性维生素的测定举例,维生素B1的测定(THIAMINE)维生素B1又称抗神经炎素，因其分子中既含有氮（N），又含有硫（S），故又称硫胺(素)。特别是在酸性介质中相当稳定。但在碱性介质中对热极不稳定。硫胺素在碱性介质中可被铁氰化钾氧化产生硫色素，在紫外光照射下产生蓝色荧光，可借此以荧光比色法定量。硫胺素能与多种重氮盐偶合呈现各种不同颜色，借此可用比色法测定。比色法灵敏度较低，准确度也稍差，适用于含硫胺素高的样品。荧光法和高效液相色谱法灵敏度很高，是目前常用的方法。,维生素B6的微生物法测定维生素B6又称抗皮炎维生素，主要以三种天然形式存在：吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺。,原理微生物分析法就是将某些微生物在含有维生素的样品提取液中的生长速率，与在含已知量维生素对照溶液中的生长速率进行对比，从而得出样品中维生素的含量。生长速率可通过测定浊度、产酸量、质量变化或呼吸作用，其中浊度分析（或光密度）是最常用的方法。维生素B6的含量在2ng/mL以内，其浓度对卡尔斯伯酵母菌的生长速率有良好的线性关系，可用微生物定量。但高效液相色谱法是目前最先进简便的方法。,维生素C的测定维生素C又名抗坏血酸，自然界存在的有L型、D型两种，D型的生物活性仅为L型的1/10。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜中含量都很丰富。维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性，进一步水解则生成2，3二酮古乐糖酸，失去生理作用。食品分析中的所谓总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，不包括二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。还原型抗坏血酸脱氢抗坏血酸2，3二酮古乐糖酸,氧化,氧化,测定维生素C的2、6-二氯靛酚滴定法,原理：1，还原型Vc能定量地还原2、6-二氯靛酚（染料）2，2、6-二氯靛酚在中性或碱性溶液中显蓝色，在酸性溶液中显粉红色；被还原后不显色。,还原型Vc染料（显色）氧化型Vc被还原的染料（不显色）,还原型Vc的测定步骤,1.Vc标准溶液的配制2.Vc标准溶液的标定：Vc+2KIO3Vcr+2KIO23.样品溶液的制备(用2%的草酸提取)4.标准溶液的滴定(用2、6-二氯靛酚)5.样品溶液的滴定,（2）滴定吸取样品抽提过滤液510mL于50mL三角瓶中，快速加入2，6二氯靛酚溶液，直至红色不立即消失，然后一滴一滴的加入，以呈现的粉红色在15s内不消失为终点。同时作空白。,3结果计算x=(VV0)/mT100式中：x样品中还原型抗坏血酸含量，mg/100g；V滴定时样液消耗染料的体积，mL；V0空白滴定时消耗染料的体积，mL；T用标准还原型抗坏血酸溶液标定染料溶液所得出1mL染料溶液相当于抗坏血酸的量，mg/mL；m滴定时所取滤液中含有样品的质量，g。,注意:1.靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其它还原性物质（如Fe2+、Sn2+、Cu1+等）会干扰测定，测定结果往往偏高。2.提取时要尽量闭光,避氧气进入，操作要尽量缩短时间,以减少还原型Vc氧化.,补充：维生素与健康,维生素A易患人群：学龄前儿童维生素A缺乏症的临床表现：皮肤症状：皮肤干燥、脱屑、粗糙，继而发生丘疹，好发于上臂外侧及下肢伸侧、肩部、臀部、背部及后颈部；由于呼吸道上皮发生角化，气管、支气管易受感染，幼儿还可引起支气管肺炎眼部表现：常表现为暗适应能力下降，即当从光亮的环境突然进入到黑暗处时，人的眼睛看清楚暗处物体的时间延长。严重者在暗光下无法看清物体，成为夜盲症，俗称雀目眼。维生素A缺乏症的预防和治疗：1预防：注意平日多吃一些富含维生素A的食物，和/或含有丰富的胡萝卜素的黄绿色蔬菜和水果，因为胡萝卜素在体内可以转化为维生素A，同样可起到预防维生素A缺乏的作用；也可选用适当的维生素A强化食品2治疗：在医生的指导下，口服维生素A制剂，如鱼肝油等我国规定维生素A的最高可耐受摄入量为：418岁2000mg视黄醇当量/天18岁以上3000mg视黄醇当量/天孕妇2400mg视黄醇当量/天中毒表现：头疼、视力模糊、恶心、呕吐、眩晕、失眠、食欲不振、腹痛、腹泻、皮肤干燥、搔痒、长骨末端外周部疼痛、头发稀疏、肝肿大等，孕妇维生素A中毒，还可能导致胎儿畸形,维生素D维生素D缺乏症：小儿佝偻病与成人骨软化病易患人群：小儿佝偻病常见于3岁以下的儿童，尤其是1岁以内的幼儿；成人骨软化病多见于孕妇、乳母及老年人。维生素D缺乏症的临床表现：小儿佝偻病的表现：患儿常有多汗、易惊、出牙迟及枕秃等症状。患儿患病3个月以上，出现乒乓头，即两侧后枕部下按有乒乓球感；肋下缘外翻；胸部前凸成鸡胸；两下肢膝部外弯成O形腿或内弯成X形腿；腹肌软弱无力，腹胀。患儿生长发育缓慢，免疫力低，易患肺炎、腹泻等病，病死率较高，容易骨折。成人骨软化病的表现：腰背部和腿部不定位时好时坏的疼痛，通常活动时加剧；四肢抽筋，骨质疏松、变形，易发生骨折。维生素D缺乏症的预防与治疗：1预防：适当户外活动（每日至少2小时）；有意识地补充含维生素D丰富的食物；或选择适当的维生素D强化食品；或在医生指导下，适量补以维生素D制剂2治疗：在医生的指导下，服用维生素D制剂及含钙制剂维生素D最高耐受摄入量及中毒：我国规定最高耐受摄入量：各年龄组均为20mg/天中毒表现：食欲减退、厌食、恶心、烦躁、呕吐、口渴、多尿、便秘或腹泻交替出现，钙在各脏器如心脏、血管、肾、肺等沉积，出现肌肉无力、关节疼痛等，严重者会造成死亡,维生素E维生素E，广泛存在于食物中，且在体内贮留的时间较长，一般不会造成缺乏。易患人群：脂肪吸收不良（患口炎性腹泻、胰腺病变）者、新生婴儿（尤其是早产儿）、多不饱和脂肪酸摄入过多者，可能会引起维生素E的缺乏。维生素E缺乏已很少见。临床表现：维生素E缺乏主要表现为神经系统功能低下，出现中枢和外周神经系统的症状。维生素E缺乏还可能导致一些老年人免疫力低下。新生婴儿（尤其是早产儿）缺乏维生素E，可引起新生儿溶血性贫血。维生素E的营养状况评价：正常值范围（mg/L）:成人血浆维生素E浓度50200儿童血浆维生素E浓度5313维生素E缺乏症的预防和治疗：1预防：注意平时含维生素E丰富的食品的摄入，做到合理营养、平衡膳食2治疗：有明显症状者，可在医生的指导下，使用维生素E制剂等维生素E的可耐受最高摄入量及中毒：国际上规定维生素E的可耐受最高摄入量为800mg-生育酚当量的维生素E。未发现有关维生素E中毒的报导。维生素E的主要食物来源：维生素E主要存在于各种油料种子及植物油中，某些谷类、坚果和绿叶蔬菜中也含一定量的维生素E，肉、奶、蛋及鱼肝油中含量较少。,维生素B1维生素B1缺乏症：脚气病维生素B1，又称硫胺素，长期缺乏可引起脚气病易患人群：长期以精白米为主食，而又缺乏其它副食补充者；婴儿型脚气病通常发生在25个月的婴儿。脚气病的临床表现：干性脚气病：食欲不振、烦燥、全身无力、下肢沉重、四肢末端感觉麻木。肌肉酸痛，有压痛，以小腿肚的腓肠肌最明显，上、下肢肌无力，出现手、足下垂，严重者出现肌肉萎缩、麻木，膝反射降低或消失，常表现为对称性。婴幼儿还可引起声音嘶哑和失音。湿性脚气病：表现为浮肿，多见于足踝，严重者整个下肢水肿。同时出现活动后心悸、气短，并有右心室扩大，常可导致心力衰竭婴儿型脚气病（脑型）：食欲不佳、呕吐、呼吸急促、面色苍白、心率快甚至突然死亡脚气病的预防和治疗:1.预防：合理安排膳食，所吃主食不要过于精细，并注意各种副食的补充。同时，采用正确的烹调方法-不要加碱，尽量不用高压锅蒸煮，以避免维生素B1遭到破坏2.治疗：根据缺乏程度，在医生的指导下，口服或肌肉注射维生素B1制剂维生素B1的可耐受最高摄入量及中毒:我国规定维生素B1的可耐受最高摄入量为50mg/天,目前还没有关于使用维生素B1引起中毒的报导维生素B1的食物来源:谷类、豆类、坚果类、瘦猪肉及动物内脏等食物是维生素B1的丰富来源,维生素B2维生素B2，又称核黄素，是我国居民膳食中最容易缺乏的维生素。易患人群；各年龄组人群均易因缺乏而致各种疾病。临床表现：口角炎：口角湿白、口角裂开、出血、糜烂、结痂舌炎：舌肿胀、裂纹、疼痛、萎缩、舌苔厚、部分脱落形成地图状唇炎：嘴唇发干、裂、肿胀、出血、溃疡眼炎：视力模糊、怕光、流泪、视力减退、眼易疲劳、角膜充血皮肤症状：引起脂溢性皮炎，多发生在鼻翼两侧、脸颊、前额及两眉之间。男性阴囊发痒、红肿、脱屑、渗出、结痂并伴有疼痛感。女性阴部瘙痒、发炎、白带增多继发性贫血：可出现缺铁性贫血的一系列表现维生素B2缺乏症的预防和治疗：1预防：合理安排膳食，平时注意多食一些含核黄素丰富的食物2治疗：一般患者可口服维生素B2素片剂，严重缺乏的患者可以肌肉注射维生素B2维生素B2的可耐受最高摄入量及中毒症状：无最高限量，也没有维生素B2中毒症状的报导维生素B2的食物来源：动物性食物，特别是动物内脏如肝、肾、心，以及鳝鱼、蛋、奶等含有丰富的核黄素；植物性食物中以豆类及绿叶蔬菜含量较多，谷类、一般蔬菜和水果含核黄素较少,维生素B12维生素B12，又称为钴胺素、氰钴素，其缺乏较少见，可见于胃切除病人、胃壁细胞出现自身免疫的病人、老年人、萎缩性胃炎患者等。维生素B12缺乏的临床表现：1恶性贫血：当缺乏B12时，导致红细胞中DNA合成障碍，诱发巨幼细胞贫血。2神经系统损害：维生素B12缺乏可引起斑状、弥漫性的神经脱髓鞘，出现精神抑郁、记忆力下降、四肢震颤等神经症状。3引起高同型半胱氨酸血症，从而增加心血管病的危险性，并可造成神经系统损害。维