免疫组织化学技术-免疫组织化学方法.ppt

免疫组织化学技术,免疫组织化学技术,基本原理通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。,组织与细胞材料的制备免疫组织化学方法,组织与细胞材料的制备,组织石蜡切片制作组织冰冻切片制作细胞爬片制作细胞涂片制作,切片的制作,组织的固定组织石蜡包埋切片,目的:（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。,组织材料的固定,固定液的选择：(1)甲醛固定液：10福尔马林，10中性福尔马林，10中性缓冲福尔马林(2)4多聚甲醛固定液(3)BouinS液及改良BouinS液(4)ZenkerS液(5)ZamboniS液(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸25ml。(8)KanovskyS液(9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。(10)PEG液(11)0.4%对苯醌(12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液(13)丙酮及醇类固定剂,固定时间：固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。,大组织：75乙醇30120min，85乙醇30120min，95醇2h，95乙醇2h，95乙醇过夜，无水乙醇3060min，无水乙醇3060min，无水乙醇60min120min，二甲苯、和各15min（可视观察结果而定），石蜡30min石蜡12h，石蜡23h。小组织：75乙醇30min，85乙醇30min，95乙醇1h、1h、过夜或2h，无水乙醇、和各30min，二甲苯15min、10min、10min（肉眼观察），石蜡30min，石蜡30min，石蜡12h。,组织石蜡包埋,切片,载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2h。切片粘合剂的使用：（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。（2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）干净载玻片丙酮5min用镊子夹住浸入APES试剂（1ml+50ml丙酮）13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。（3）铬矾明胶液：铬矾0.5g明胶5gH2O21000ml（4）甲醛明胶液：40甲醛2.5ml明胶0.5gH2O2100ml,切片：石蜡切片：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)5260烤片18h。(3)切片厚24m。(4)切片刀要快(5)编上号(6)切片可在4保存数年冰冻切片：(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理24h，冰冻切片。(2)冰冻切片后需凉干后立即固定(3)冰冻切片固定后-80保存备用,细胞爬片制作,将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。待细胞生长达到60以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上。可加甘油封存置于零下20度保存。,细胞涂片制作,离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗23遍，最后用PBS将细胞重悬。吸取3050ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。待稍微风干以后加4多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定24小时。在细胞上加一层甘油放-20保存。,免疫组织化学方法,荧光标记免疫组织化学,酶联免疫组织化学,荧光标记免疫组织化学,直接法间接法,酶联免疫组织化学,ABC法S-P法,免疫组化二步法,二步法免疫组化染色步骤,二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯PBS冲洗3次，每次3分钟根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性PBS冲洗、浸泡5分钟，3次正常山羊血清室温封闭10分钟,甩去血清，加入适当稀释的一抗，37孵育60分钟或4过夜PBS冲洗，浸泡5分钟，3次滴加多聚螯合物，37孵育30分钟PBS冲洗，浸泡5分钟，3次新鲜配置酶底物显色液DAB显色310分钟流水冲洗苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜观察拍照IPP软件分析光密度,抗原修复方法,真空负压抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压干燥箱预先调至95，真空负压处理10分钟。待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。,微波辐射抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。,高压抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续14分钟。待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。,隔水热抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH0.6）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92）。即开始计时，持续40分钟。待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。,电炉加热抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92后，即可拔离电源，当温度低于92时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。,胃蛋白酶消化法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。PBS洗3次，1分钟/次。滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20分钟左右。PBS冲洗3次，2分钟/次。后按选择好的免疫组化该法进行染色。,胰蛋白酶消化法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。PBS洗3次，1分钟/次。滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20分钟左右。PBS洗3次，2分钟/次。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。,注意事项,一、抗体的保存浓缩抗体：有效期内，只需放在4冰箱内，保存时间可达1-3年。即用型抗体：理论上在4冰箱内可保存半年左右。PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放置1-2个月。,二、出现假阳性的原因组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假