徐州感染性腹泻综合监测工作方案

附件：徐州市感染性腹泻综合监测工作方案（2012年，试行）一、背景感染性腹泻病仍然是当今全球性重要公共卫生问题之一，尤其在发展中国家，其发病率高，危害大，是影响人类身体健康，特别是青少年、儿童生长发育的重要疾病。我国腹泻病发病率很高，感染性腹泻的发病率居传染病首位。引起该病的病原很多，其中以细菌引起腹泻者占比例最大，随着抗生素药物在感染性腹泻病治疗中的广泛应用，出现了耐药及新的肠道致病原。因此，监测肠道致病菌的种类具有十分重要的意义，以掌握我省感染性腹泻流行特征和病原菌（毒）株变化趋势，为制定有效的预防控制措施提供科学依据，特制定此方案。二、监测工作目的1、掌握我市感染性腹泻的发病强度，及时了解感染性腹泻疫情动态，为制订防治对策提供参考依据。2、了解我市重点感染性腹泻病原分布特征和变化趋势，为预防控制提供科学依据。三、监测病例定义腹泻病监测病例定义：（1）1岁及以上儿童、青少年及成人：每日排便3次及以上，并伴有大便性状的改变，呈稀便、水样便、粘液便或脓血便等；（2）婴儿：大便次数比平常增加，大便性状改变，伴呕吐、或/和食欲下降、或/和脱水(如尿少、口渴)；6个月内母乳喂养儿排便达每日6次及以上、人工喂养儿每日排便4次以上，6个月1岁每日排便4次以上；（3）同一患者间隔7d (含7d)再次腹泻，为发生另1次腹泻。霍乱、伤寒、副伤寒、细菌性痢疾、其它感染性腹泻病的诊断参照相应的国家卫生行业诊断标准。四、监测点设置选择铜山区、泉山区和睢宁县为综合监测区。选择市级医院1家（徐州市第一人民医院）、区及县级医院各1家（铜山区中医院和睢宁县中医院）、社区服务中心（城区和农村）各2家（铜山区汉王镇卫生院和棠张镇卫生院、睢宁县王集镇卫生院和高集镇卫生院）开展腹泻病流行病学监测和病原学监测标本采集；医疗机构监测科室应包括内科（消化内科）、儿科和感染科的门诊（肠道门诊）、急诊部门。五、监测工作内容（一）感染性腹泻综合监测1、流行病学综合监测通过长期、连续监测腹泻病例就诊数及占就诊总数百分比的动态变化、腹泻病人的流行病学特点，并综合腹泻病原分离情况，分析判断本地区感染性腹泻流行趋势。监测哨点医院全年开展腹泻病监测，对符合病例定义标准的各年龄组所有就诊腹泻病人专册登记（附表1），逢泻必登。监测医院每旬逢3前将上一旬资料负责整理到附表2中并报至属地区县疾控中心，区县疾控中心每旬逢4前将上旬报表（附表2）汇总上报至市疾控中心。市疾控中心每旬逢5前将上旬报表（附表2）汇总上报至省疾控中心。已建立完善HIS系统的监测哨点医院，可逐步开发利用HIS系统诊疗信息，从信息系统获取“肠炎、腹泻、腹痛、呕吐、食物中毒”等胃肠道相关症状及诊断信息，实现监测工作的信息化。2、病原学常规监测综合监测点医院全年开展细菌性痢疾及病毒性腹泻病原监测。（1）标本采集：监测哨点医院相关科室的医护人员发现符合感染性腹泻病例定义的患者（尤其是诊断为细菌性痢疾和病毒性腹泻病例）时，按照方案要求收集相关信息（附表3），并采集粪便或呕吐物标本，一式两份。一份标本12小时内送检进行细菌性痢疾检测，另一份置于-20或以下冷冻保存，用于病毒性腹泻检测。标本采集时注意做好标本编号记录。每月采集标本总数不少于20份（泉山区不少于4份、铜山区和睢宁县各不少于8份）。标本采集、保存、运输要求详见附录1。（2）病原检测：检测细菌性痢疾和病毒性腹泻相关病原（轮状病毒、星状病毒、札如病毒、诺如病毒、腺病毒）。细菌性痢疾标本检测由有条件的医院负责，不具备条件的由属地区、县疾控中心负责，检测内容包括病原分离、生化鉴定和血清学分型。病毒性腹泻检测由市级疾控中心负责每月统一检测。当月病毒性腹泻标本检测应在下月5日前全部完成。病原检测方法详见附录1。（3）信息报告：各地疾控中心每月5日前将上月病原检测结果上报市疾控中心，市疾控中心每月7日前将汇总结果（附表4和附表5）上报到省疾控中心急传所；每月10日前将上月分离痢疾菌株和病毒性腹泻PCR阳性标本上送至省疾控中心急传所。3、病原学加强监测综合监测区各监测医院，在4月、8月、12月开展感染性腹泻病原学加强监测，检测6种细菌性病原、5种病毒性病原。根据肠道传染病防制形势的需要，可适时增加需关注的病原监测种类和样本数量。（1）标本采集：监测医院按季节不同，分三批次（4月、8月、12月份）集中采集连续3日内（标本量不足的，适时延长期限）的就诊腹泻病例样本；其中4月和12月每批次标本采集数不少于20份（泉山区不少于4份、铜山区和睢宁县各不少于8份），8月标本采集数不少于30份（泉山区不少于6份、铜山区和睢宁县各不少于12份）。相关科室的医生或护士在发现符合病例定义的患者时，按照方案要求收集相关信息，并采集粪便标本（填写附表3）；标本采集后12小时内，连同附表3一起送至属地区县疾控中心，区县疾控中心登记整理后立即送市级疾控中心实验室检测。标本采集、保存、运输要求详见附录1。（2）标本检测：细菌性病原：沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、致泻性大肠埃希菌；病毒性病原：轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、腺病毒、星状病毒。标本检测工作由市级疾控中心统一负责检测。检测方法见附录1。（3）信息报告：市级疾控中心负责及时收集病原检测信息，在下月7日前将上月病原检测结果（附表4和附表5）上报到省疾控中心急传所；下月10日前将上月分离阳性菌株和病毒性腹泻PCR阳性标本上送至省疾控急传所。（二）霍乱监测重点传染病病原监测主要包括重点传染病霍乱和发病率较高的细菌性痢疾、病毒性腹泻；全市各级医疗机构按照肠道门诊江苏省医疗机构肠道门诊设置规范（试行）明确的有关要求开设肠道门诊（4-10月份），认真做好腹泻病人登记、采样、调查、处理、消毒及疫情报告、信息汇总等工作。1、病例与人群霍乱检索4-10月份，全市所辖肠道门诊送检数要不少于腹泻病人总数的15%、年终总人口数的1，以提高病人发现的敏感性。菌株检测与及菌株保存要求详见徐州市霍乱防制工作计划。2、外环境与食品霍乱监测依据年度全市霍乱防制工作要求和所辖地区霍乱流行形势，监测区于4-10月份自行选择有代表性的点，开展水、海（水）产品及食品中霍乱病原监测。（三）国家专项监测按照有关国家级单病种监测方案的要求，铜山区承担的肠出血性大肠杆菌O157：H7与耶尔森监测两项国家级监测任务须保质保量地完成。（四）其它工作要求1、标本和菌种保存与上送病毒性腹泻粪便标本采集后须立即放置-20冷冻保存，冷藏运输，避免反复冻融和泼洒溢漏。2、数据分析、报告与反馈（1）数据分析：及时对监测数据进行分析，包括：感染性腹泻病人的年龄、性别与季节分布，各感染性腹泻病原的检出情况等。（2）数据报告与反馈：区县疾控中心腹泻病流行病学监测数据每旬逢4前上报到市疾控中心疾控科。市疾控中心每旬逢5前上报到省疾控中心，每月7日前将上月病原检测结果（附表4和附表5）上报到省疾控中心；每月10日前将上月分离阳性菌株和病毒性腹泻PCR阳性标本上送至省疾控中心。年度总结于下年度1月10日前上报至省疾控中心。3、监测工作质量评估对监测工作相关单位开展督导检查，评估并促进各级单位监测工作的质量。评估指标包括工作及时性、准确性和覆盖范围等，包括：资料收集的完整性、准确性和及时性；人员培训情况；信息报告及时性和规范性；标本送检的及时性和实验室检测的及时性；实验室检测的规范性；技术资料档案管理，包括原始记录规范性和完整性等。（附录6）六、监测系统组成与职责监测系统由各级卫生行政部门、各级疾病预防控制中心、医疗机构组成。（一）各级卫生行政部门各级卫生行政部门负责组织开展本辖区内感染性腹泻综合监测工作，提供所需监测补助经费并监督经费使用情况，保证监测工作的顺利开展。（二）市级疾病预防控制中心负责本地区感染性腹泻综合监测的日常管理、业务指导工作；负责对监测资料进行收集、汇总和分析，开展病原学检测，并及时对各项结果进行报告与反馈，保质保量地完成监测任务。（三）区县级疾病预防控制中心按监测工作方案要求，配合医院完成标本送检以及进行部分实验室检测等工作；对辖区内哨点医院的监测工作开展质量控制和业务指导；按规定时限向市级疾控中心报告监测资料。（四）医疗机构医疗机构处在发现感染性腹泻病例的最前沿，负责完成门（就）诊和住院病例的腹泻病人的登记和标本采集，有条件的参与部分实验室检测任务；配合疾病预防控制机构完成本方案所要求的其它监测工作等。七、技术支持与联系方式市疾控中心对承担感染性腹泻综合监测的区县疾控中心、哨点医院提供技术支持与指导。技术支持部门：徐州市疾控中心疾控科。现场联系人：孙传武（），石春雷（）。实验室联系人：病毒检测：童晶（）细菌检测：郭惠（）八、附表与附录附表1 医疗机构腹泻门诊病例登记表附表2感染性腹泻病人登记检索旬报表附表3感染性腹泻标本采集登记表附表4 感染性腹泻综合监测细菌性病原检测结果反馈表附表5 感染性腹泻综合监测病毒性病原检测结果反馈表附表6 感染性腹泻综合监测疑似病原菌菌株送检表附录 标本采集、保存、运输及检测技术指南附表2 感染性腹泻病人登记检索旬报表（月旬）日期分年龄组腹泻病报告数门/急诊就诊总数0岁5岁15岁60岁本旬合计附表6 感染性腹泻综合监测疑似病原菌菌株送检表标本编号病人姓名分离病原菌名称菌株编号API编码VITEK2编码血清型填报单位： 送检人： 送检日期： - 7 - 附表1 医疗机构腹泻门诊病例登记表（医院名称：门诊：）日期姓名性别年龄(岁)工作单位职业住址联系电话发病日期初/复诊主要症状初步诊断采样情况送检日期检验项目检验结果医师签名填表人： 填表日期： 年 月 日附表3 感染性腹泻标本采集登记表标本编号患者姓名性别年龄职业现住址及联系电话发病日期是否服抗生素主要临床症状采样日期（具体到“时”）采样方式体温腹痛腹泻恶心呕吐其他粪便粪便性状肛拭子呕吐物月日时月日时月日时月日时月日时&患者姓名：5岁以下患儿加注家长姓名.*粪便性状：1.鲜血样便 2.血便相混 3.脓血便 4.黑便 5.粘液便 6.米泔水样便 7.水样便 8.稀便 9.正常便填表人： 填表日期： 年 月 日附表4 感染性腹泻综合监测细菌病原检测结果反馈表（年月）标本编号患者姓名性别年龄(岁)职业发病日期检测日期细菌性病原体霍乱弧菌副溶血弧菌致泻性大肠埃希菌空肠弯曲菌沙门菌志贺菌*病原体阳性检测结果需具体到血清亚型填报单位： 填报人： 填报日期：附表5 感染性腹泻综合监测病毒性病原检测结果反馈表（年月）标本编号病人姓名性别年龄职业发病日期检测日期轮状病毒杯状病毒诺如病毒札如病毒腺病毒星状病毒G分型P分型填报单位： 填报人： 填报日期：附录：标本采集、保存、运输及检测技术指南一、标本采集（一）标本的采集采集粪便标本，由受过专门培训的人员来施行，并填写附表3。优先采集就诊时未使用过抗生素的病例标本。注意生物安全防护，防止污染、传播和自身感染。标本应做好相应标记。采集粪便使用无菌容器。用6支无菌棉拭多点采集粪便标本（如有脓血或黏液应挑取脓血、黏液部分，液体粪便应取絮状物，使棉拭表面布满粪便），分别插入1支C-B运输培养基，棉拭子应尽量全部插入培养基内，以保证弯曲菌所需的微需氧环境，迅速拧紧管口。另外再分5ml粪便放到无菌粪便采样杯（盒）（不加任何培养基和试剂），置于-20或-20以下冷冻保存。（二）标本的保存和运输用于细菌检测的粪便标本如不能立即送检，需保存于4冰箱或冷藏包，但不应超过12小时。用于病毒检测的粪便样本采集后30min内放入-20 冰箱中，保存期内避免样本发生反复冻融。所有标本置于冷藏包（配备冰排），由专职人员运输至监测点实验室，在动输过程中需防止容器破碎、洒漏、颠倒，注意生物安全防护。粪便样本的保存、运送和检测培养条件见表1。二、细菌检测（一）标本处理1、直接分离培养：采集的标本直接划线接种选择性平板进行培养，包括麦康凯平板、XLD平板、STEC平板、科玛嘉沙门菌显色平板、科玛嘉弧菌显色平板、TCBS平板，放置37培养；接种mCCD平板，放置42微需氧环境下培养。2、增菌培养：将标本同时接种于碱性蛋白胨水，于37培养6小时后，接种科玛嘉弧菌显色平板或TCBS平板；接种SGB增菌37培养18小时后，接种科玛嘉沙门菌显色平板；接种3%氯化钠蛋白胨水增菌液，37培养1216小时后，接种于科玛嘉弧菌显色平板或TCBS平板；接种Preston肉汤增菌42微需氧培养2448小时，接种改良CCD平板，42微需氧培养1天5天。（二）菌株分离和鉴定1、菌落形态鉴定：在STEC显色平板上挑取5个形态特征典型的可疑产毒性大肠杆菌菌落分别保存在半固体培养基中送省CDC进行后续检测；在其它各种选择性培养基上分别挑取5个形态特征典型的可疑菌落(参考附录5相关内容：病原体在不同选择性培养基上的菌落特征)进行纯化或血清凝集试验，同时进行革兰染色。2、生化鉴定：初步生化鉴定包括氧化酶试验、动力、双糖等。对经初步生化鉴定结果符合的菌株用API生化鉴定条或全自动生化鉴定仪进行系统生化鉴定。如使用VITEK2鉴定者，要求将每株疑似菌株鉴定报告附于菌株送检单后面。3、血清学鉴定：使用病原菌特异血清进行玻片凝集，初步血清鉴定后再进行血清分型。（三）疑似菌株的保存和运送除志贺菌、空肠弯曲菌和副溶血性弧菌不上送外，其它菌株分别接种半固体琼脂，37过夜，在室温下保存送检，不要冷藏。病毒核酸检测阳性的粪便标本冷藏送省CDC。表1 粪便样本的保存、运送和检测培养条件项目培养基目标病原体温度细菌标本保存和运送1.Cary-Blair氏运送培养基所有感染性腹泻综合监测致病菌4增菌液1.3%氯化钠碱性蛋白胨水副溶血性弧菌372.碱性蛋白胨水霍乱弧菌373.Preston肉汤弯曲菌微需氧424.SBG增菌液沙门菌37选择性分离平板1.Mac平板EPEC、STEC、ETEC、37EIEC、EAEC、志贺菌2.XLD平板志贺菌373.mCCD平板弯曲菌微需氧424.科玛嘉沙门氏菌显色平板沙门菌375.科玛嘉沙门氏菌显色平板弧菌376. TCBS平板弧菌377.STEC平板产志贺样毒素大肠杆菌37病毒标本1.采便盒轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒20以下（四）检验方法与工作流程1、工作流程与方法汇总粪便标本病毒检测：塑料盒装标本细菌分离：Cary-blair氏运送培养基；6管，每管插1支棉拭子20保存送市疾控检验：轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒（RT-PCR）结果报告;阳性标本送省疾控中心复核鉴定样本管1样本管2样本管3样本管4样本管5样本管6碱性蛋白胨水增菌SBG增菌液3%氯化钠碱性蛋白胨水Mac和XLD分离STEC分离TCBS分离改良CCD分离志贺菌大肠菌霍乱菌弯曲菌科玛嘉沙门菌显色培养基科玛嘉弧菌显色培养基或TCBS沙门菌副溶血弧菌鉴定结果报告，按要求上送菌株Preston肉汤增菌2、副溶血性弧菌检验程序粪便标本3%氯化钠碱性蛋白胨水TCBS或科玛嘉弧菌显色培养基挑取3个或以上可疑菌落，接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂氧化酶试验，3%氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验进行系统生化鉴定血清学分型报告结果360C10C，12h16h360C10C，18h24h360C10C，18h24h3、沙门菌和志贺菌检验程序粪便标本SBG增菌液科玛嘉沙门显色培养XLD和MAC挑取3个或以上可疑菌落，接种于5%羊血琼脂平板TSI，赖氨酸，MIO，西蒙氏柠檬酸盐琼脂，尿素TSI:K/Ag+赖氨酸:+MIO:+/-/+柠檬酸盐:+尿素:-TSI:K/A tr赖氨酸:+MIO:+/-/-柠檬酸盐:-尿素:-TSI:K/Ag赖氨酸:-MIO:+/-/+柠檬酸盐:-尿素:-TSI:K/A赖氨酸:-MIO:-/V/-柠檬酸盐:-尿素:-TSI:K/A赖氨酸:-MIO:-/-/+柠檬酸盐:-尿素:-反应结果与左侧描述不符沙门氏菌属伤寒沙门氏属甲型副伤寒沙门氏菌志贺氏菌属宋内志贺氏菌可能是肠道菌群，或者需要额外试验以其它致病菌或生化不典型的沙门氏菌或志贺氏菌分离株进行系统生化鉴定、血清学试验报告直接360C10C，18h24h360C10C，18h24h360C10C，18h24h360C10C，18h24h4、弯曲菌检验程序420C10C，24h48h420C10C，1d5d420C10C，24h48h粪便标本Preston 肉汤马尿酸钠水解试验、吲哚乙酸酯水解试验改良CCD琼脂平板挑取3个或以上可疑菌落，接种哥伦比亚血琼脂平板氧化酶试验、过氧化氢酶试验、革兰氏染色镜检报告结果5、病原体在不同选择性培养基上的菌落特征选择性琼脂平板病原体菌落特征MAC琼脂平板志贺菌属菌落光滑、无色，直径23mmXLD琼脂平板志贺菌属菌落呈红色，直径24mm科玛嘉沙门菌显色培养基沙门菌（大多数）紫色或酒红色TCBS琼脂平板副溶血性弧菌圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径23 mm霍乱弧菌光滑、凸起、边缘完整、黄色菌落科玛嘉弧菌显色培养基副溶血性弧菌圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径23mm霍乱弧菌绿松石蓝色改良CCD琼脂平板空肠弯曲菌灰绿色菌落、非常干燥，有或无金属光泽STEC显色培养基大肠杆菌大肠杆菌O157：H7紫色大肠杆菌O26紫色带荧光其他产志贺毒素大肠杆菌紫色，荧光或有或无其它肠杆菌无色、蓝色或被抑制三、腹泻病毒检测（一）检测流程粪便标本RV抗原检测核酸检测ProSpect Rotavirus Kit按说明操作Geneaid病毒核酸提取试剂盒提取阳性标本G/P分型诺如、札如、星状及腺病毒的RT-PCR检测结果与报告（二）核酸提取：采用Geneaid病毒核酸提取试剂盒。（三）病毒检测：采用QIAGEN Probe RT-PCR Kit荧光定量检测各种腹泻病毒。1、引物及探针：省CDC合成并下发。2、反应体系（模板2.5l）试剂体积（l）DEPCH2O2.875Master MIX6.250RT-MIX0.125引物+0.250引物0.250探针0.2503、反应条件病原种类温度时间循环数轮状病毒5030min9515min9515s45Cycle601min星状病毒5045min9515min9415s45Cycle551min札如病毒5030min9515min9415s40Cycle5534s诺如病毒5030min9515min9510s45Cycle601min腺病毒9515min9515s45Cycle601min4、结果分析条件设定和结果判断:Ct值无数值的标本为阴性样本；Ct值35.0的样本为阳性。注:Ct值35.0的样本建议重做；重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。（四）轮状病毒阳性的标本进行血清型分型和基因型分型采用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit及GenStar公司的2 Mix。1、RT-PCR所用的引物（1）VP7 RT-PCR*PrimerSequence 5-3Nucleotide Position (expected size cDNA 881bp)VP7FATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC51-71VP7RAAC TTG CCA CCA TTT TTT CC932-914* (Iturriza Gomara et al., (2001) J Clin Micro)（2）G-Typing PCR*TypePrimerSequence 5-3NucleotidePositionSize PCR product (bp)G1aBT1CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G314-335618G2aCT2CAA TGA TAT TAA CAC ATT TTC TGT G411-435521G3G3ACG AAC TCA ACA CGA GAG G250-269682G4aDT4CGT TTC TGG TGA GGA GTT G480-499452G8aAT8GTC ACA CCA TTT GTA AAT TCG178-198754G9G9CTT GAT GTG ACT AYA AAT AC757-776179*(Gouvea et al., (1990) J Clin Micro; Iturriza Gomara et al., (2004) J Clin Micro)（3）VP4 RT-PCR*PrimerSequence 5-3Nucleotide Position (expected size cDNA is 663 bp)VP4FTAT GCT CCA GTN AAT TGG132-149VP4RATT GCA TTT CTT TCC ATA ATG775-795* (Simmond et al., (2008) J Clin Virol)（4）P-Typing PCR*TypePrimerSequence 5-3NucleotidePositionSize PCR product (bp)P42T-1CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC492-474362P63T-1TGT TGA TTA GTT GGA T