小鼠骨髓细胞染色体标本制备和核型分析.ppt

小鼠骨髓细胞染色体标本的制备/观察/核型分析,武汉大学生命科学学院,1,染色体技术的发展,1920年提出；直到1956年，AlbertLevan和华裔学者蒋有兴应用低渗处理、秋水仙素和植物凝激素，才使该技术得到了实质性的发展和完善；20世纪70年代，出现了多种染色体显带技术，提高了染色体分析的精确度；20世纪80年代中期，荧光原位杂交、显微切割及染色体涂染等新技术的出现，使染色体细胞水平的研究与分子水平的探索衔接起来。,2,染色体技术的应用及其意义,染色体技术应用领域：临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学、特殊细胞的标记、杂种细胞的鉴定等。染色体技术应用意义：(1)用于染色体组型分析；(2)物种的特征及种属亲缘关系；(3)分析物种的变异和进化过程；(4)识别单条染色体及基因定位；(5)染色体疾病研究、肿瘤学研究及产前诊断；(6)环境毒物、临床药物毒性检测。,3,染色体核型：指一个物种所特有的染色体数目和每一条染色体的形态特征。-人类体细胞中共有23对染色体，22对常染色体，一对性染色体。核型分析：将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特征分析的过程称核型分析。核型模式图：是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。,4,常用实验生物和人细胞DNA含量与染色体数目,5,数目（2n=？）长度（绝对长度、相对长度）着丝粒位置（MSMSTT）随体与次溢痕的数目、大小和位置带型分析,染色体的特征,6,染色体的形态类型,1.001.671.683.003.017.007.01,7,染色体观察及核型分析,8,染色体技术在临床医学方面的应用,9,(顺铂引起的小鼠染色体畸变),染色体技术在药理学及毒理学方面的应用,10,中国水韭属植物体细胞中期分裂相A.云贵水韭;B.高寒水韭;C.台湾水韭;D.中华水韭,物种的特征及种属亲缘关系分析物种的变异、进化过程,11,染色体标本材料来源及制备过程,植物细胞染色体制片技术(根尖、花粉母细胞等)前处理-酶解去壁-低渗-固定-解离-染色-压片动物染色体制片技术(骨髓细胞、体外培养细胞等)取骨髓细胞(体外培养细胞)-低渗-固定-滴片-染色人体染色体制片技术(体外培养组织细胞、外周血淋巴细胞、胸腹水细胞、胎儿绒毛标本、实体瘤标本、羊水细胞、及皮肤、肝、肾标本)快速法：注射秋水仙素-低渗-固定-滴片-染色,12,一、目的要求,1.掌握小鼠骨髓细胞染色体标本的制备方法；2.掌握染色体分组特征,对染色体核型进行分析;3.了解并制备小鼠染色体核型图。,13,二、实验原理,染色体的形态结构在细胞增殖周期中是不断地运动变化的，一般在有丝分裂中期，染色体的形态最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，从而积累大量处于分裂中期的细胞。骨髓细胞是一种增殖细胞，利用上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠骨髓细胞的染色体。,14,三、染色体制备的实验材料、试剂和用具,实验材料：体重1825g的小白鼠；实验试剂：200g/ml秋水仙素、生理盐水、0.075MKCl低渗液、Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）、pH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液；实验用具：眼科剪、眼科镊、草纸、1ml注射器、10ml注射器、10ml刻度离心管、低速离心机、恒温水浴锅、温度计、酒精灯、吸管、载玻片、染色架、100ml盐水瓶、定时钟、废液缸、显微镜。,15,16,四、实验步骤,1.取材前小鼠按2g/gBW腹腔注射200g/ml秋水仙素作用2.5小时。2.取材：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出完整股骨并纱布擦净。,17,3.收集细胞：剪去股骨两头，用生理盐水冲洗股骨髓于离心管中，反复数次，至骨髓发白，15002000r/min离心8min，弃上清。4.低渗处理：将约7ml预热37C的低渗液加入离心管中，吸管混匀，再置于37C恒温水浴锅中保温15min(中途用吸管混匀一次)。5.预固定：取出离心管，向管底加入1ml新配制的固定液(甲醇：冰乙酸=3：1)，混匀，平衡，8001000r/min离心10min，弃上清。6.固定：向沉淀物中加入新鲜固定液5ml，用吸管轻轻吹打均匀，室温静置15min，平衡后8001000r/min离心10min，弃上清。7.再固定：方法同步骤6。,四、实验步骤(续),18,8.制备细胞悬液：弃上清，留下沉淀物，加固定液0.20.3ml，用吸管轻轻吹打均匀。9.滴片：取干净湿冷玻片，将其倾斜30，取少许细胞悬液于玻片上一定距离23滴于载玻片上(不要重叠)，用口轻轻吹散，在酒精灯火焰过几下。10.染色：在玻片标本上滴加Giemsa染液(Giemsa原液：pH6.8磷酸缓冲液=1：9)并铺匀，染色15min，用细自来水缓缓冲去染液至干净，晾干。,四、实验步骤(续),19,11.小鼠骨髓细胞染色体观察（1）小鼠骨髓细胞染色体计数：选择20个染色体形态较典型、分散较好的分裂相计数小鼠骨髓细胞的染色体数。（2）小鼠染色体形态的观察：小鼠的染色体呈“U”形，全部为端部着丝粒染色体。可配成20对，分成4组，其中一对为性染色体。X染色体大小在56号之间，Y染色体最小。,四、实验步骤,20,小鼠骨髓细胞染色体图,21,五、注意事项,固定液和Giemsa染液须现配现用；低渗时间应掌握准确(？)；低渗后的细胞吹打时动作要轻，离心速度不能高于1000r/min(？)。,22,1.材料：染色体的中期分裂相照片。2.软件：ImageJ(/ij/),核型分析,23,24,25,26,27,28,29,1、染色体的测量测量长短臂的长度（Q、P）确定各对同源染色体选择其