体内药物分析方法及方法的设计与评价PPT课件

体内药物分析生物制药分析，设计和评价体内药物分析方法和手段，以及2。生物样品预处理后，选择合适的方法进行测定。测定生物体液中药物和代谢物含量的分析方法很多，可归纳为三类：(1)光谱分析(2)免疫分析(3)色谱分析。3，除了上述三种主要方法外，同位素标记药物有时也用于生物药物分析。它们主要用于放射免疫分析、同位素反向稀释分析，或作为气相色谱-质谱分析的内标，以及示踪剂在药物分离中的应用等。此外，还有一些含有抗生素药物的生物样品，可以通过微生物方法进行测定。利用抗生素在琼脂培养基中的扩散效应，比较样品产生的抑制区大小和药物标准对接种的试验菌的影响，确定样品中抗生素药物的浓度。(1)光谱分析，包括比色测定、紫外分光光度法和荧光分光光度法。光谱学方法是用于体内药物分析的早期方法之一。根据陆明廉对我国1975年至1984年血药浓度测定方法的统计，应用光谱法占全部应用血药分析方法的三分之一。虽然近十年来色谱技术的快速发展使得光谱法不再是体内药物分析应用的主导方法，但由于其操作简单、快速，在体内药物分析中仍占有一定的地位。由于光谱法没有分离功能，选择性差，因此对样品的预处理要求高。选择特定的方法或试剂与其反应，以测量衍生物的荧光或光吸收强度，或通过数学方法消除干扰。比色法的灵敏度不高，通常只能测定浓度超过1ug/ml的样品。然而，该方法快速、简单，对仪器要求低。只要采用选择性显色剂和反应条件，就可以直接用于血药浓度监测，无需分离提取等步骤。紫外分光光度法的灵敏度高于比色法。适用于紫外吸收药物的测定。方法简单，对仪器要求不高。然而，当用于测定低药物浓度的样品时，它也是有限的。如果测量体液中的药物浓度，它也可能受到体液中内源性杂质的干扰和影响。因此，这种方法在体内药物分析中也受到灵敏度和特异性的限制。然而，一些光谱分析技术，如差示分光光度法、导数分光光度法、双波长分光光度法和三波长分光光度法，可以适当提高方法的灵敏度和选择性，消除杂质的干扰。因此，该方法仍用于某些生物样品中的药物检测。荧光分光光度法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法，最高可达10-12g/mL。虽然荧光物质的量很少，但许多重要的生化物质、药物及其代谢物或致癌物在体内都有荧光现象。由于荧光衍生试剂的使用，荧光分光光度法的应用得到了进一步拓展，因此该方法已广泛应用于体内药物分析和药代动力学研究。(2)免疫分析。免疫分析主要指放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析等。这种方法的原理是利用抗原抗体特异性反应来测定体内药物的含量。该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速等优点。这是临床药物浓度监测和生化检测的常用方法，但需要某些试剂盒和仪器。色谱分析方法包括高效液相色谱法、气相色谱法和薄层色谱法。色谱在体内药物分析中的应用始于20世纪80年代。由于其分离和分析功能、高特异性和灵敏度，以及同时分离和分析具有相似结构的药物和代谢物，色谱在过去20年中发展迅速，尤其是高效液相色谱，其在体内药物分析领域确立了主导地位，并且通常用作评价其它药物的参考方法近年来，手性色谱、毛细管电泳、色谱与光谱联用技术、色谱与免疫联用技术的建立和发展，为色谱技术在体内药物分析中的应用增添了无限的前景。高效液相色谱在体内药物分析中的应用大大超过了其他分析方法，成为体内药物分析中应用最广泛的技术之一。与气相色谱法相比，它具有以下优点：(1)适用范围广，可在室温下检测。对于低挥发性、差的热稳定性，可以测量大分子量和离子化合物。(2)样品前处理简单，无需提取和衍生，可直接测定大极性水溶性药物，特别适用于生物样品的测定。(3)分离效率高，流动相选择范围广，仪器自动化程度高。(4)检测器主要用于检测整个分子的光谱特征，具有很高的特异性。检测方法大多是非破坏性的。流出物成分可以回收，并可用于样品制备。13，2，气相色谱法，气相色谱法是第一种具有分离和分析两种功能的测量技术，已广泛应用于药物分析和体内药物分析。由于高效液相色谱的发展，特别是反相高效液相色谱的广泛应用，气相色谱的应用相对减少。原因是气相色谱方法本身存在一些缺点，并且其应用经常受到被测组分的挥发性和热稳定性的限制。气相色谱法测定药物一般需要在120以上的柱温下进行，不适用于热不稳定、极性大或挥发性差的药物，也不适用于生物样品的测定。因此，影响了该方法在体内药物分析中的广泛应用。(4)毛细管电泳，又称高效毛细管电泳(HPCE)，是20世纪末发展起来的一种高效、快速的分析技术。HPCE是一种液相分离技术，它利用高压电场作为驱动力，毛细管作为分离通道，根据样品各组分之间的迁移率和分配系数的不同来实现分离。HPCE近年来发展迅速，已被广泛应用于化学、生命科学和药学领域。因为该方法具有高效、快速、灵敏、样品引入少、信息量大、操作成本低、易于自动化等优点。因此，它被广泛用于体内药物分析和代谢检测。根据HPCE方法的不同分离模式。HPCE也分为毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等电电泳和毛细管电色谱。近年来，这些方法在体内药物分析中得到了不同程度的应用。哪种方法更适合体内药物分析？一般来说，应根据药物的物理和化学性质、结构持久性、药物浓度、干扰成分的量、预处理方法、实验目的和实验室条件来考虑。(1)要做好文献总结和整理工作，确定报道的药物，就要系统总结以往的文献，找出哪些问题已经解决，哪些问题仍然存在。对于文献中未报道的药物，也可根据其性质参考同类药物的文献。(2)充分了解待测药物的特性和体内情况，药物的理化性质和体内过程是建立该方法的主要依据。药物的物理和化学性质包括酸性和碱性(pKa)、亲脂性、溶解性、极性、光谱特性、稳定性等。这些性质与分析方法的选择和实验条件的改善密切相关。与传统的分析方法不同，体内药物分析的对象是来自生物体的样品，因此有必要了解药物在体内的状态，如药代动力学参数、体内代谢等。这包括采样频率和采样间隔、分析方法的选择等。(3)明确确定的目的和要求。应该理解，该方法是否临床药物浓度监测要求方法简单、快速。此外，如果需要同时测定母体药物和代谢物，如果需要同时测定两者，应选择单独或唯一的测定方法。(4)结合实验室条件，考虑实验室现有和可能的设备条件，选择可行的方法。该方法初步拟定后，需要进行一系列实验来选择最佳实验条件，并验证拟定的方法是否适用于实际样品检测。一般包括以下步骤：(1)取适量的纯药物或其代谢物，按照所提出的方法进行测定，得到浓度与测定响应值之间的关系，并选择线性范围、最佳浓度、检测灵敏度和最佳条件(如酸碱度、温度、反应时间等)。)进行测定。(2)空白样品的测定，取空白生物样品，根据所提出的方法进行处理，并测定空白值(或色谱图)。空白值或色谱图的水平将影响方法的灵敏度和特异性，应努力降低空白值。在色谱分析中，我们应该尽最大努力减少体内样品中的内源性杂质峰，并且我们应该尽最大努力去除不能从分析物的色谱区域消除的内源性杂质峰。能否获得良好的空白试验结果是决定该测定方法实际可行性的重要环节，必须解决。(3)用水替换空白样品，添加标准品和测量品，用水替换空白生物样品，添加标准品和测量品，按照拟定的方法了解提取回收率和最低检测浓度的概况，从而选择提取溶剂、酸碱度、挥发性浓度等条件。(4)空白样品加标后测定，空白生物样品加一定量的标样后根据所提出的方法测定，得到样品回收率数据并建立标准曲线。如果使用色谱法进行测定，在大多数情况下，定量需要内标方法，应首先选择合适的内标，然后测定回收率。(5)体内实际样品的测定。实际样品应在上述步骤(1)至(4)后确定。但是，应该指出的是，上述步骤只是生物样品真实样品测试前的准备工作，并不能完全确定它们是否适合真实样品测试。由于药物在体内的变化是复杂的，如果不重视药物代谢和蛋白质结合，体外建立的方法在体内实际样品测定中往往会失败，甚至导致错误的结论。因此，在方法的设计中，强调对药物在体内的过程有一定的了解，从而选择避免干扰的、适合样品实际情况的方法。有时，也可以使用已经被证明用于体内真实样品测定的具有强特异性的程序和方法作为对照测定，以测试所建立的方法的实际可行性。为了所建立的体内药物分析方法的可行性和可靠性，需要应用几个标准来进行方法研究和评估。这是研究和建立新的分析方法时必须把握的几个环节。为了评价体内药物分析方法的优缺点，主要有以下指标：精密度、准确度、灵敏度、特异性或选择性、可测量的浓度范围、测定所需的时间以及对生物样品的适应性等。选择以下内容进行讨论：(1)准确度，准确度是方法评估的最基本的要点之一，它表示测定结果与真实值之间的符合程度。常用的回收率反映了测定的准确性，也可以通过与其他已建立的方法进行比较来反映。将已知量的纯药物添加到空白样品(例如血液样品)中，并且在一系列处理和测定之后，获得的药物量与添加量的比率的百分比是回收率。当然，回收率越接近100%，越好。然而，由于成分复杂且低绝对回收率，又称萃取回收率和萃取回收率，反映了一种方法的萃取效率，与体内样品的检测灵敏度有关，是评价体内药物分析方法的重要指标之一。以色谱法为例，说明了绝对回收率的计算过程。例如，取一定量的待测药物标准品，加入空白血样中，按照规定的方法进行处理，使药物标准品在最终溶液中的浓度为1ug/mL，测量色谱峰面积，记录为试验a，再取1ug/mL药物标准品的纯溶剂溶液，记录测得的色谱峰面积为真，用外标法计算。绝对回收率应考虑三种浓度：高、中、低。低浓度应在LOQ附近，高浓度应在标准曲线的上限附近，并应选择中间浓度。回收率的大小和变化不应要求太高。通常，添加量在10-6 10-9的范围内。如果绝对回收率能达到50% 80%，则认为是令人满意的。色谱分析中经常使用内标方法来测定含量。将药物标准物质和内标物质添加到空白血液样品中，并根据规定的方法进行处理，以测量药物和内标物质的峰面积，并且确定它们的比率R在药物/a之内。此外， 注射相同浓度的药物标准物质和内标物质的纯溶剂溶液，得到药物标准物质和内标物质的峰面积，计算药物标准物质和内标物质的比值r为true=a药物/a。 嘿。34、在内标方法中，应注意的是，用外标法测定的药物和内标物质的绝对回收率应相近，两者之差应小于10%，否则回收率偏离100%太远。方法回收率：在空白体液中加入一系列浓度的药物标准物质，按照设定的方法测定。根据标准物质的浓度和响应的测量信号值绘制标准曲线。回归方程首先由最小二乘法得到。然后，在空白体液中加入高、中、低浓度的药物标准品，每种浓度至少5个样品平行测定，按照标准曲线制备法用同样的方法测定。将获得的信号值代入回归方程以获得测量值。最后，通过与加入量的比较，得出了该方法的回收率。除了定量限度外，在每个浓度点测得的平均值与实际添加量的偏差应小于15%，定量限度应小于20%。在测定回收率时，无论采用何种方法，都应注意以下问题：加药量必须接近实际测定量；(2)添加的物质必须与实际存在状态相似；(3)必须同时做空白试验。以上两点的原因是：第一，如果添加量大，实际测量量小，测量量可能在回收率的误差范围内，不可靠；第二，如果添加量大，蛋白质的实际结合能力小，则空白血样中存在的添加药物部分不结合，与实际情况不符，测定的回收率容易偏高。因此，在报告一种方法的回收率时，必须说明添加的量。该方法的准确度有时可以与新建立的方法同时通过一种被证明是非常具体和可靠的方法来测量，然后比较两种方法测量的结果的相关度。相关系数r用于表示一般要求r 0.95，直线斜率接近1，表示两种方法一致。精度是一组测量值相互一致的程度。有很多种表达方式。在体内药物中常用的表达方法有所谓“批内”是指在相同条件下的分析和测定，如同一批试剂、同一条标准曲线等。日间(或批与批之间