色谱法分离原理

第十四章：色谱分离原理。第一节概述了色谱是一种重要的分离和分析方法，它根据组分在两相中的不同功能达到分离的目的。早在1903年，当俄罗斯植物学家茨维特分离植物色素时，色谱就被使用了。在研究植物叶子的色素成分时，他把植物叶子的提取物倒入一个装满碳酸钙的垂直玻璃管中，然后加入石油醚使其自由流动。结果，颜料中的成分彼此分离，形成不同颜色的带。这种方法因此被称为色谱法。后来，这种方法逐渐应用于无色物质的分离。虽然“色谱”这个词已经失去了它的原意，但它今天仍然被使用。马丁和辛格提出了液-液色谱理论。1952年，詹姆斯和马丁开发了气相色谱。1956年，范德米特提出了速率理论。柯克兰等人开发了高效液相色谱。20世纪80年代以后，出现了一系列新的色谱分析方法，如毛细管电泳和毛细管电动色谱。在色谱法中，填充在玻璃管或不锈钢管中的固定相(固体或液体)称为固定相。从上到下移动的相(通常是气体或液体)称为流动相。含有固定相(玻璃管或不锈钢管)的管道称为色谱柱。当流动相中的样品混合物通过固定相时，它将与固定相反应。由于每个组分的性质和结构以及与固定相相互作用的类型和强度的不同，在相同的驱动力下，不同组分在固定相中的保留时间不同，因此以不同的顺序流出固定相。从不同的角度来看，色谱可以分为以下几类：1 .根据两相状态以气体为流动相的气相色谱称为气相色谱，根据固定相是固体吸附剂还是固定液(附着在惰性载体上的薄层有机化合物液体)，气相色谱可分为气固色谱(GSC)和气液色谱(气液色谱)。同样，液相色谱可以分为液-固色谱(LSC)和液-液色谱(有限责任公司)。以超临界流体为流动相的色谱是超临界流体色谱。随着色谱法的发展，固定液体通过化学反应结合到载体表面。这种化学键合固定相的色谱也被称为化学键合相色谱(CBPC)。根据分离机理，分离方法称为吸附色谱法。通过在固定液体(固定相)中的不同溶解度来分离组分的方法称为分配色谱法。利用离子交换剂(固定相)上组分的不同亲和力来分离组分的方法称为离子交换色谱法。利用不同大小的分子在多孔固定相中的选择性渗透来实现分离的方法，称为凝胶色谱法或大小排阻色谱法。最近，出现了另一种新的分离技术。利用不同组分的亲和力和固定相(固定分子)的高特异性进行分离的技术称为亲和层析，通常用于蛋白质分离。3。根据固定相的出现分类固定相填充在柱色谱中，称为柱色谱。固定相是平板色谱，称为平板色谱，可分为薄层色谱和纸色谱。4.根据展开程序的分类，根据展开程序的不同，色谱法可分为洗脱法、置换法和迎头法。洗脱也称为冲洗。工作时，首先将样品加入色谱柱头，然后使用吸附或溶解能力比样品成分弱得多的气体或液体作为冲洗剂。由于每种组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，由冲洗剂进行的顺序也不同，因此组分彼此分离。流出曲线如下图所示。该方法能使样品组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，纯度较高的物质在置换法中，将样品加入色谱柱头后，将比所有样品组分对固定相的吸附或溶解能力更强的物质加入惰性流动相中作为置换剂(或置换剂直接用作流动相)。通过色谱柱，组分根据吸附或溶解能力的顺序从固定相中依次排出。显然，吸附或溶解能力最弱的组分将首先流出，而吸附或溶解能力最强的组分将最后流出。置换法的流出曲线如下图所示。该方法适用于制备纯物质或浓缩分离某一组分。缺点是，一次使用后，色谱柱被样品或置换剂饱和，只有在更换色谱柱或去除色谱柱吸附的物质后才能再次使用。迎头法是将样品混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分先以纯物质状态流出，然后是吸附或溶解能力较弱的第一组分和第二组分的混合物，依此类推。流出曲线如下图所示。在分离多组分混合物时，除了第一组分之外，该方法是不纯的，因此它仅适用于从含有痕量杂质的混合物中切割高纯度组分(组分A)，而不适用于分离混合物。(1)色谱流出曲线和检测器输出的色谱峰信号强度随时间变化，得到的曲线称为色谱流出曲线。曲线上突出的部分是色谱峰。如果注射体积小且浓度低，色谱峰在吸附等温线(气-固吸附色谱)或分配等温线(气-液分配色谱)的线性范围内对称。(2)基线在实验操作条件下，色谱柱后面没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定基线应为水平直线。(3)峰高色谱图的峰顶和基线之间的垂直距离，用(h)表示。色谱流出曲线和色谱峰基线(a)峰高(h)，(iv)保留值1。当未被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到达到最大峰值所需的时间称为死时间，死时间与色谱柱的空隙体积成正比，如下图所示。因为这种物质不会被固定相吸附或溶解，所以它的流速与流动相的流速相似。当测定流动相的平均线速度时，可以使用柱长L与tM之比来计算，即=L/Tm。2.保留时间tR从进样到色谱柱后的最大峰值点所经过的时间称为保留时间，如下图所示。调整后的保留时间tR扣除死时间后的组分保留时间称为组分调整后的保留时间，即tR=tRtM时间，因为组分在色谱柱中的保留时间tR包括组分通过流动相柱所需的时间和组分保持在固定相所需的时间，tR实际上是组分保持在固定相的总时间。保留时间是色谱定性的基本依据，但同一组分的保留时间往往受流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。4。死体积V0是指色谱柱填充后，色谱柱管中固定相颗粒之间的剩余空间、色谱仪中管道和连接器之间的空间以及检测器空间的总和。当后两项非常小且忽略计时时，死体积可从死时间和色谱柱出口处的载气流速Fco(cm3min-1)计算得出。V0=tMFco，其中Fco是扣除饱和水蒸汽压力后由温度校正的流速。仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。5。保留体积VR指的是从样品引入开始到被测组分浓度达到柱后最大值时流动相的体积。保留时间与ret的关系在定性分析中，通常将一个色谱峰固定为标准(S)，然后计算该峰的其他峰的相对保留值(I)。此时，它可以用符号表示，即=Tr(1)/Tr(2)，其中Tr(1)是后一峰值的调整后的保留时间，因此它总是大于1。相对保留值通常可用作衡量固定相选择性的指标，也称为选择因子。(5)区带宽度色谱峰的区带宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于测量柱效率和反映色谱操作条件的动态因素。通常有三种方法来指示色谱峰面积的宽度。1。标准偏差即色谱峰宽的一半是峰高的0.607倍。2.半峰宽Y1/2-对应半峰高的峰宽。其与标准偏差的关系为Y1/2=2.3543。峰底宽度Y -即基线上色谱峰两侧拐点切线截距之间的距离。它与标准偏差的关系是y=4。从色谱流出曲线中，可以获得许多重要信息：(1)根据色谱峰的数量，可以判断样品中所含成分的最小数量；(二)可以根据色谱峰的保留值进行定性分析；(三)可以根据色谱峰的面积或峰高进行定量分析；(四)色谱峰的保留值及其面积宽度是评价色谱柱分离效率的基础；色谱峰的两个峰之间的距离是评价固定相(或流动相)选择适用性的基础。色谱分析的目的是将样品中的成分相互分离。为了实现组分的完全分离，两个峰之间的距离必须足够远。两个峰之间的距离由两相之间组分的分配系数决定，即它与色谱过程的热力学性质有关。然而，尽管两个峰之间有一定的距离，但如果每个峰都很宽，以至于彼此重叠，就不能分开。这些峰的宽度或窄度由色谱柱中组分的传质和扩散行为决定，即它与色谱过程的动力学性质有关。因此，色谱行为应从热力学和动力学两方面进行研究。(1)分配系数K和分配比k1。分配系数K分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间的重复分配过程，而吸附色谱的分离是基于重复吸附-解吸过程。这种分离过程通常由样品分子在两相之间的分布来描述，描述这种分布的参数被称为分布系数K，它(K)是指当组分分布在固定相和流动相之间以在一定温度和压力下达到平衡时的浓度比，即，K=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度=Cs/Cm。分配系数由组分和固定相的热力学性质决定。它是每种溶质的特征值，只与两个变量有关：固定相和温度。它与两相的体积、色谱柱的特性和使用的仪器无关。分配比k分配比也称为容量因子，指在一定温度和压力下，当两相之间的组分分布达到平衡时，在固定相和流动相中分配的物质的数量比。也就是说，k=固定相中的物质的量/流动相中的物质的量=ns/nm，k的值越大，固定相中的组分的量越多，这相当于色谱柱的大容量，因此也称为分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对分离组分保留能力的一个重要参数。k值也由组分和固定相的热力学性质决定。它不仅随塔温和压力的变化而变化，而且与vo有关假设色谱柱中流动相的线速度为u，色谱柱中各组分的内部速度为us。由于固定的相对分量具有保留效应，因此这两个速度的比值称为保留因子Rs。如果Rs以质量分数表示，即组分和流动相通过长度为l的色谱柱所需的时间分别为、结束表达式(18-14)至(18-17)和、4。分配系数k与分配比k和选择因子之间的关系表示如下：=tr(b)/tr(a)=k(a)/k(b)=k(a)/k(b)实验测量值k通过选择因子与热力学性质的分配系数k直接相关，表示为固定相。如果两个组分的k或k值相等，=1，两个组分的色谱峰将重合，表明它们不能分离。两个组分的K值或K值之间的差异越大，分离越好。因此，两种组分具有不同的分配系数是色谱分离的前提。下图显示了沿色谱柱移动时，组分A和组分B在不同位置的浓度分布。因此，图中的KAKB组件在移动过程中落后。随着色谱柱中两种组分移动距离的增加，两个峰之间的距离逐渐增加，同时，每种组分的浓度分布(即面积宽度)也逐渐变宽。显然，区域扩张不利于分离，但却是不可避免的。为了完全分离成分A和成分B，必须满足以下三点：第一，两个成分的分布系数必须不同；第二，区域加宽的速率应该小于区域分离的速率。第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长度的色谱柱。第一点和第二点是完全分离的必要条件。作为一种色谱理论，它不仅要解释组分在色谱柱中的移动速率，还要解释在组分移动过程中导致区域变宽的各种因素。塔板理论和速率理论都是建立在色谱过程中分配系数不变的前提上，所以它们被称为线性色谱理论。色谱研究的核心是选择最合适的色谱系统和条件，在最短的时间内达到最佳的分离效果。(2)塔板理论将色谱柱比作精馏塔，用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相之间的分布行为。同时，引入理论塔板数作为衡量柱效的指标，即色谱柱由一系列连续等长的水平塔板组成。每个托盘的高度用h表示，h称为托盘高度，或简称托盘高度。托盘理论假设：1。在塔中的短长度h内，组分可以快速达到两相之间的平衡。这种短柱长称为理论塔板高度h. 2。以气相色谱为例，进入色谱柱的载气不是连续的，而是脉动的，入口气体一次为一个塔盘体积(Vm)。3.所有组分最初都存在于0号塔板上，样品沿轴向(纵向)的扩散可以忽略不计。4.分配系数在所有塔板上都是恒定的，与塔板上的组分数量无关。简单地认为：在每个塔板中，溶质将很快达到两相之间的分配平衡，然后随着流动相一个接一个地向前移动。对于长度为L的色谱柱，溶质平衡的数量应为：n=L/Hn，称为理论塔板数。与蒸馏塔一样，塔效率随着理论塔板数n的增加而增加，随着塔板高度h的增加而降低。根据上述假设，在色谱分离过程中，该组分的分布可以计算如下：在开始时，如果将该组分的单位质量，即m=1(例如1mg或1g)加入0号塔板，在分布平衡后，由于k=1，即ns=nm，nm=ns=0.5。当具有板体积(LV)的载气以脉动形式进入0号板时，包含气相部分组分的载气被推到1号板。这时，ns偏了塔板理论指出：首先，当塔中溶质的平衡数，即理论塔板数n大于50时，可以得到基本对称的峰曲线。在色谱柱中，n的值通常非常大，例如，气相色谱柱中的n约为103-106，因此此时流出曲线可以接近正态分布曲线。第二，当样品进入色谱柱时，只要各成分在两相之间的分配系数略有不同，经过反复分配平衡后，仍可获得良好的分离效果。第三，n与半峰宽和峰底宽之间的关系是：n=5.54(tR/Y1/2)