生化试剂性能评估及稳定性测试流程和方法

.,生化试剂性能评估及稳定性测试流程和方法,高开显生化试剂研发部2009.10.26,.,内容提要,测试简介测试主要内容分析性能测试稳定性测试,.,测试简介,定义：是对事物进行评价的过程，是为确定某种事物存在特性或真实性而采取的方法和手段。目的和意义保证设计开发质量保证产品质量确认产品规格符合规格需求,.,测试简介,试剂测试的特殊性试剂是由生物或者化学物质所组成；试剂是批次生产的，同一批次内具有均匀性和一致性；试剂是一种具有存储有效期和使用有效期的物质。,.,测试主要内容,规格验证：只是一个客户角度的验证功能/性能验证：对产品参数进行验证，保证产品质量法规标准符合性验证临床性能环境/安全、可制造性、风险管理等,.,测试主要内容-法规标准符合性,SFDA注册国标与行标，如：WS/T124-1999临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则、GB临床化学体外诊断试剂（盒）通用技术要求（报批稿）企业标准临床试验、注册检验、现场质量体系审核CE认证IVD指令：98/79EC协调标准质量体系，自我测试，自我宣称，现场质量体系审核FDA注册21CFR820FDA指南文件代理机构，文档审核，现场质量体系审核,.,测试主要内容-标准分类,国际标准（ISO）欧盟标准（EN）国家标准行业标准企业标准,.,测试主要内容-举例：欧盟协调标准,98/79ECIVD指令EN13640稳定性测试EN13612性能评估EN375产品标识EN980符号使用EN13641传染性风险降低ISO13485质量控制ISO14971风险管理,.,测试主要内容-研发各阶段测试任务,小试阶段：保证产品功能的实现，确认符合预期的规格；中试阶段：从产品级别进行测试的阶段，是保证产品符合要求的最重要阶段；试产阶段：主要针对可制造性、生产稳定性进行测试，保证能够按要求生产出合格的产品；试用阶段：产品都未经过市场验证的，试用阶段主要是从市场使用角度进一步验证产品的性能，也包括对正式生产后生产稳定性的验证。,.,测试主要内容-测试工作流程,制定测试计划，安排测试资源；设计测试方案，确定具体的测试项目及可接收标准；测试过程实施；统计数据，进行分析，编写测试报告。,.,测试主要内容-方案的设计与编制,明确该测试的目的与要求；查阅相关法规和标准（国标、行标、产品标准等等）的要求；查阅相关的通用测试方案；确定测试的范围以及具体测试项目；综合上述要求，制定合适的测试方案。,.,测试主要内容-测试方案内容,该项测试的任务及目的；测试所需的资源；测试所使用的样品信息；样品的预处理过程，测试的环境条件；需要进行的测试项目；测试所需要达到的标准；其他需要说明的内容。,.,测试主要内容-测试报告内容,测试所依据的方案；测试涉及到的样品；所有得到的测试结果；由测试得到的结论。,.,分析性能测试-主要内容,试剂空白吸光度分析灵敏度线性范围精密度干扰分析准确度,.,试剂空白吸光度,每种试剂都有一定的空白吸光度范围，其改变往往提示该试剂的变质；原则上，吸光度上升的反应，其试剂空白吸光度越低越好，不能超过一个高限。反之亦然；试剂空白吸光度限值，常作为程序参数输入仪器，如经核查超限，仪器会自动报警，提示更换试剂；举例：利用Trinder反应为原理的检测试剂会因含酚类物质被氧化为醌而变为红色。,.,试剂空白吸光度-测试方法,测定待检试剂在测定波长、371条件下检测蒸馏水的吸光度A；将试剂更换成蒸馏水，再测定吸光度B；试剂空白吸光度值=A-B。,.,分析灵敏度,定义：检测系统可检测的样本中最低分析物浓度；检测低限：定性含义；功能灵敏度：定量含义。,.,检测低限（LLD）,定义：样本单次检测可以达到的非空白检测响应量对应的分析物量。检测系统或方法对小于或等于检测低限的分析物量只能报告“无分析物检出”。计算：通常估计95%和97.5%的两种可能性95%可能性：LLD=X(空白)+2SD(空白)99.7%可能性：LLD=X(空白)+3SD(空白),.,检测低限-疑问？,问题：大于检测低限的响应信号说明样品内含有分析物，但方法还不能正确报告定量结果；原因：在这样低的浓度或其他量值范围内，单次检测样品的反应响应量重复性较差；疑问：在多少检测响应量时才能较好地报告定量结果呢？结论：功能灵敏度。,.,功能灵敏度（FS）,定义：以天间重复CV为20%时对应检测限样本具有的平均浓度，确定为检测系统或方法可定量报告分析物的最低浓度或其他量值的限值。注意：为估计FS，须用多个检测限浓度来确定在低浓度处的精密度表现，从中选择具有或最近于20%CV值的对应浓度，为可定量报告的最低浓度。,.,线性范围,参照文件：CLSIEP6-A:2003（定量测量程序线性评价：统计方法）。定义：线性：在给定范围内，提供的测量结果与样品中被检测物的量直接成比例的能力；线性范围：测试系统可接收线性的范围，即在此范围内非线性误差小于规定误差。,.,线性范围-样本要求,证实系统的线性范围：选用5-7个浓度，每个浓度重复2次；建立系统的线性范围：使用横跨期望报告范围的9-11个浓度。更多的点和比预期报告范围大30的范围，可用减少点来发现最宽的可能线性范围；5点被认为是可靠描述线性范围的最小数：更多的点将提供对线性更精确的描述及更宽的线性范围，即使有些点需要被删除。,.,线性范围-可接收基质的分类,理想的样本基质：病人样本混合物；高值样本-添加了分析物的病人样本混合物：如果将一个浓缩的分析物溶液添加到混合物中，尽可能小的稀释病人样本混合物（推荐小于10）；低值样本-用处理过的低浓度物质或混合物质稀释的混合物：如果可能，使用低浓度病人样本混合物。另外，一定的处理可以减小分析物浓度，例如透析，加热及层析；其他。,.,线性范围-样本添加物的选择,使用一些推荐的天然材料必须考虑溶解度；必须认真选择天然材料的酶来源以确保酶的活性和人来源的材料相等，并且添加物不影响结果；如果可以得到的话，人来源的酶可能是最合适的选择，然而这些物质通常很昂贵；已证实的参考物，一些来自NIST和ACS的化学物质适合许多一般的分析物如葡萄糖，钠，氯化物等；样本添加物的选择可参照EP-6A文件：表1。,.,线性范围-注意事项,分析次序-随机临床重要评价浓度最小分析浓度或线性范围下限；多种医学决定水平；最大分析浓度或线性范围上限。,.,线性范围-计算方法举例,将血清样本随机排列，每个样本重复测定3次，计算其平均值；以线性上限物加入量为横坐标（x），测定结果均值为纵坐标（y）作线性回归；计算相关及各测定平均值和线性回归值的相对偏差（S）等。,相对偏差S=（实测平均值线性回归值）/线性回归值,.,精密度,参考文件：CLSIEP5-A2（临床化学设计的精密度评价）；定义：在规定的条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。,.,精密度-分类,批内精密度批间精密度仪器内不精密度（EP5-A2）,.,精密度-批内精密度,重复测试20次；计算均值（X）和标准差（S）；变异系数,.,精密度-批间精密度,三个批次的试剂测试样本各3次；计算均值；按公式计算相对偏差。,.,精密度-仪器内不精密度,操作流程分装准备2个水平的待测样本；每天取出2个标本，每个项目每天测定2批(间隔不得少于2小时)，双份测试，共测定20天；在此期间，保证试剂批号、测定参数和定标系数的不变；离群点的检查：实验过程中，如每次双份测定的差值超过初步精密度测定时标准差的5.5倍，这对数据为“离群点”，应弃去并重做；按公式计算结果。,.,精密度-仪器内不精密度,目的：评价整个系统的仪器内总不精密度；本实验中没有合并可能很重要的变异源如校准物和试剂批号的不同，技术员/操作者的不同；影响精密度的其他一些因素：如样本预处理，测试物稳定性，携带率和漂移等均包含在内；可通过合并多设备，多操作者，多批号试剂和校准液及校准周期（如果适当）而减少，但这通常增加精密度标准差。,.,精密度-基本要求,样品一定要稳定，且应与新鲜的临床病人标本性能接近，稳定的冷冻混合血清是首选；样本中的分析物含量应在该项目的医学决定水平处，尽可能做两个水平的精密度实验；采用冷冻保存的样品一定要注意内含分析物的稳定，要严格控制冻融、混匀的操作；一个分析系统上的检测数据只能反应该系统的精密度性能，不能代表该项目在所有机型上的性能，亦不能代表该检测系统对所有项目检测的性能。,.,分析干扰,参照文件：EP7-A（临床化学检验的干扰评价）定义：指某一物质对某分析物的浓度或催化活力测定中任何一步骤的影响作用成为分析干扰；分析物（analyte）是标本中准备测定的成分；干扰物（interferent）也是标本中的一个组分，它不是被分析物，但它改变最后的结果。,.,分析干扰-干扰对偏倚的影响,总分析误差主要有三个原因：不精密度、方法特有偏差和样品特有偏差；方法评估常常仅评估前两个；样本偏差（如干扰）通常被认为是特定样本单独的问题，而不是方法可被定量的特性。,.,分析干扰-干扰的机制,化学作用：如干扰物和试剂竞争或抑制指示反应；物理作用：如干扰物具有和分析物相似的性质，如能产生荧光，颜色等；基体效应：干扰物可能改变标本基体的物理性质，如浊度、黏度等；酶的抑制：干扰物能通过抑制金属激活剂、和催化点的结合、或氧化必须的巯基等改变酶（分析物或试剂）活力；非特异性：干扰物会和分析物以同样方式参与反应；其他。,.,分析干扰-干扰物测试的浓度,为确定在最坏情况下一种物质是否存在干扰，应当在实验室分析的患者样本中期望观察到的最高浓度处进行全面的干扰筛选。药物和代谢物：报告的治疗剂量最高浓度的2倍处测试；内源性物质：确定预期的患者群体期望的最高浓度；抗凝血剂和防腐剂：5倍推荐的添加浓度；进食的物质：测试2倍的期望的最大浓度；注：部分干扰物浓度可参照EP7附录推荐浓度。,.,分析干扰-常分析干扰物,抗坏血酸黄疸溶血脂血,.,分析干扰-具体测试步骤,干扰原液的配制不同浓度干扰血清标本的制备测试及结果判断,.,分析干扰-干扰原液的制备,干扰物：获得可能干扰物合适的纯形式，或这种物质最接近循环形式的形式。溶剂：选择一种足以溶解测试物的溶剂，一些可能的溶剂按一般的优先顺序如下列出：纯水、HCL或NaOH稀释液、乙烷或甲醇、丙酮、二甲基磺胺、其他有机溶剂。,.,分析干扰-干扰原液的制备,抗坏血酸、黄疸、脂血：分别称取一定量的抗坏血酸纯品、胆红素纯品和内源性酯纯品溶于纯水（胆红素溶于0.1mol/L的NaOH溶液中）中，充分混匀后得到干扰原液；溶血：以新鲜全血自制溶血干扰物；收集普通全血标本，充分离心；吸走上清液，加入510mL的生理盐水，适度摇动混匀清洗沉积细胞，离心，吸走上清液；重复三次上述过程后离心收集沉淀，加入与沉淀等体积的去离子水，混匀，室温静置10min后置冰箱-20冷冻过夜，复融后充分离心，收集上清液，在血液细胞分析仪上测试血红蛋白浓度，血红蛋白浓度应加去离子水调整至100g/L。,.,分析干扰-不同浓度干扰血清标本的制备,方法将加有干扰原液溶剂的新鲜病人血清和加有同体积干扰原液的相同病人血清进行梯度混合；注意基础混合物：最好为没有吃药的健康个体获得的新鲜样本；其次为冷冻或冻干样本。,.,分析干扰-测试及结果判断,将不同浓度干扰物血清标本分别测试3次；以未加入干扰物的血清样本为标准，计算其他样本与该样本的相对偏差；一般以相对偏差绝对值超过10%判断为对待测项目有干扰，以相对偏差绝对值不大于10%判断为该浓度对待测项目没有显著干扰。,.,准确度,定义：一个测量值与可接收的参考值之间的一致程度。常见方法相对偏差回收试验比对试验（重点介绍）,.,准确度-方法（相对偏差）,用参考物质或有证参考物质（CRM）和相应的参考测量程序对试剂进行测试，取测试均值，计算相对偏差：B%=（M-T）/T*100%其中：M-测试结果均值；T-有证参考物质标示值，或各浓度人血清定值；B-相对偏差。,.,准确度-方法（回收试验）,在人血清样品中加入一定体积标准溶液或纯品，每个浓度测定3次，按下式计算回收率：,.,准确度-方法（比对试验）,参考文件：CLSIEP9-A2（用患者样本进行方法比对及偏倚评估）必要性实验室准备用一个新的检测系统或测试方法进行病人标本测定前，应和原有检测系统或公认的参考方法一起检测一批病人样品，从测定结果间的差异了解新检测系统或方法引入后的偏倚；若偏倚不大，或偏倚在允许误差范围内，说明两检测系统或方法对病人样品测定结果基本相符，新检测系统或方法替代原有检测系统或方法不会对临床引入明显偏倚。,.,准确度-方法（比对试验）,测试步骤收集新鲜血清样本：被测物浓度覆盖以下范围，接近可报告范围下限，接近可报告范围上限，医学决定浓度水平附近等；测试：参照系统（X）与待检系统（Y），同时对以上血清样本进行测试，每种试剂对每个样本测试至少两次，取均值，然后以Y对X作图，得线性回归方程Y=aX+b及相关系数R；一般要求：R0.975，0.9a1.1；R、a及b的指代意义。,.,准确度-方法（比对试验）,实验要点实验时间至少做5天，长一些更好，可以客观反映实际情况；至少做40份病人样本，多一些更好。实验的可靠性和有效性随时间延长及更多的样品量而增加；尽可能50%的实验样品内分析物含量不在参考区间内，各个样本内分析物含量分布越宽越好；不要使用对任一方法已知会干扰的标本（如溶血）；将样本按某次序排列先测一次，做双份第2次测定时，样本顺序全部倒过来-可最小化批内双份测定的均值受携带和漂移的影响。,.,稳定性测试,参照文件：ISO13640:2002（体外诊断试剂稳定性研究）定义：稳定性是体外诊断试剂必须具有的基本属性、是确保产品在使用过程中安全有效的重要指标。稳定性研究是根据产品的理化性质，设计合理的稳定性研究试验项目，以考察不同条件下产品的主要质量指标随时间的变化情况，为产品的保存条件和有效期的确定提供依据。,.,稳定性测试-目的,确定试剂的贮存有效期；确定试剂在第一次打开原装包装后的使用期限（开瓶使用有效期）；监测已经进入市场的试剂的稳定性；确认试剂在经过可能影响其稳定性的更改后的稳定性。,.,稳定性测试-测试批次要求,用于支持测试目的研究的最小批次数目应该：3批用于确定新的IVD试剂的有效期（长期稳定性）1批用于模拟运输过程1批用于测试使用中的稳定性，例如，那些经过了重新组合或是最初被真空包装的试剂此外还有以下数目地批次应当进行测试：3批用于延长了有效期的IVD试剂1批用于经过改进的IVD试剂,.,稳定性测试-内容,实时稳定性研究（real-timestabilitytesting）加速稳定性研究（acceleratedstabilitytesting）,.,稳定性测试-实时稳定性研究,长期稳定性：在长期稳定性研究期间，应按规定的保存条件（例如温度、湿度等）进行稳定性研究。开瓶稳定性：为确定使用过程中的稳定性，如打开包装后的稳定性等，应充分考虑到产品在使用过程中可能遇到的各种环境因素，设置稳定性研究的试验条件，考察产品在一定时间内的稳定性。运输稳定性：运输条件的模拟应当基于对运输条件的了解（如运输时间、预计温度和湿度）。如果必要，可以进行调查来确定实际的运输条件以作为模拟的基础。,.,稳定性测试-实时稳定性研究,时间及间隔设置长期稳定性研究考察时间应涵盖所预期的有效期，且应包括足够的安全性余量，如果必要，还应持续到可以确定产品性能出现明显变化的时间。根据产品的理化性质，适当选择稳定性研究试验的时间间隔，对于环境因素敏感的产品，应适当增加考察时间点。对于由于仪器和试剂而产生的变异较大的产品，亦应适当增加考察时间点，以便能够从数据的变化趋势评价产品质量的变化情况。,.,稳定性测试-实时稳定性研究,时间间隔设置举例进行实时稳定性测试时，12个月有效期可以按照3个月的时间间隔进行测试（即0，3，6，9，12个月时分别进行测试），24个有效期月可以按照4个月的时间间隔进行测试，在进行长期稳定性研究时一般应考察至有效期后三个月。注意：间隔时间可适当调整，可根据经验前松后紧。,.,稳定性测试-实时稳定性研究,项目设置根据产品特点、质量研究项目和结果、成品检定项目和限度，选择即能够灵敏地反映产品质量的变化情况，又具有可操作性的项目作为稳定性研究试验项目，如不稳定的物理、生物或化学指标、分析灵敏度、测定准确度等。测试项目应重点考察表现其功能的性能指标。生化试剂通常选择试剂空白吸光度、质控准确度、重复性和线性范围等项目进行测试，以监控试剂随保存时间延长引起的性能变化情况。,.,稳定性测试-实时稳定性研究,结果分析实时稳定性的测试结果可以直接作为有效期确定的依据；在没有足够实时测试的数据支持的情况下，如果要用加速测试的结果来确定IVD试剂在推荐贮存条件下的有效期，则要以相似的IVD试剂的经验和/或者利用阿列纽斯方程或者其他规定的模型为依据。稳定性可以依据以前的数据或者类似试剂的稳定性或者已有的经验进行预测，但是仍然必须在随后的实时稳定性试验中得到验证。,.,稳定性测试-加速稳定性研究,定义加速稳定性研究是指采用过度的条件来增加产品的化学或物理降解的速度，从而预测其有效期。加