细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)PPT课件

1、细胞培养、2、原代培养(略)、3、2 .继代培养、准备及注意事项交换液继代冻存复苏MTT、4、准备事项、紫外线灯照射细胞室30分钟、鼓风机运转10分钟后可进入实验室。 戴专用口罩、帽子、拖鞋、工作服等。 用带手套的酒精擦拭。 准备实验所需的东西。 在洁净工作台内操作前用酒精棉球擦桌子。 洁净工作台内的操作结束后，用酒精棉球擦拭桌子，除酒精灯、镊子、试管等物品外，都拿出桌子。 用紫外线灯照射30分钟。 、5、换液，将细胞培养瓶从培育箱中取出，盖上盖子。 用倒置显微镜观察瓶内培养基的颜色、是否浑浊等，观察细胞的生长状况。 放在超清洁的桌子上，点燃酒精灯，将培养瓶口在酒精灯的火焰上旋转2次以上，至少3秒。 取下盖子，扔掉烧瓶口的培养基，取出烧瓶口的PBS液瓶，用烧瓶口和镊子的镊子取下栓子，烧瓶口(至少10转)。 吸管吸取6，6.3 ml的PBS，打入培养瓶。 烧瓶口进行培养，摇动100次PBS，降低PBS。 重复此操作一次。 7 .取出培养基瓶，用烧瓶口和镊子的镊子取下栓子，烧瓶口(至少10转)。 8 .吸管吸取5ml-8ml培养基打入培养瓶，瓶口、镊子和烧盖9 .盖上盖子，用显微镜观察，然后注明名称和日期，酒精棉球擦拭瓶口和瓶体，放入培养箱。 注意：1.打开培养箱时，请尽量不要说话2 .在步骤9中将培养瓶放入培养箱时，请稍微松开盖子。 7、继代、1 .将细胞培养瓶从培养箱中取出，盖上盖子2 .观察瓶内培养基的颜色、有无浑浊等，用倒置显微镜观察细胞的生长状况。 3 .放入超净化台，点燃酒精灯，将培养瓶口在酒精灯的火焰上旋转2次以上，至少3秒。 4 .取下盖子，扔掉烧瓶口的培养基，取出烧瓶口的5.PBS瓶，用烧瓶口和镊子的镊子取下栓子，烧瓶口(至少10转)。 吸管吸取、8、6.3ml的PBS，打入培养瓶。 烧瓶口进行培养，摇动100次PBS，降低PBS。 重复此操作一次。 7 .取出胰酶瓶，用烧瓶口和镊子的镊子取下栓子，烧瓶口(至少10转)。 8 .吸管吸入1ml胰酶，打入培养瓶，烧瓶口和盖子培养，盖上盖子9 .取出桌外，用倒立显微镜观察细胞，用酒精棉球擦拭瓶口和瓶身，放入培养箱5分钟后取出，用倒置显微镜观察细胞消化情况细胞变成单一的圆形，就可以继承。 11 .请拿到桌子上，烧瓶口，取下盖子，烧瓶口。 用吸管吸胰酶，烤瓶口。 12 .取出培养基瓶，用烧瓶口和镊子的镊子取下栓子，烧瓶口(至少10转)。 13 .用吸管吸取5ml的培养基，打入培养瓶，用吸管制成各个细胞悬浊液。 数数，分注就行了。 10、冷冻保存、1 .将细胞培养瓶从培育箱中取出，盖上盖子2 .观察瓶内培养基的颜色、有无混浊等，用倒置显微镜观察细胞的生长状况。 3 .放入超净化台，点燃酒精灯，在酒精灯的火焰上旋转培养瓶口两次以上，至少3秒。 4 .取下盖子，扔掉烧瓶口的培养基，取出烧瓶口的5.PBS瓶，用烧瓶口和镊子的镊子取下栓子，烧瓶口(至少10转)。 吸管吸取、11、6.3ml的PBS，打入培养瓶。 烧瓶口进行培养，摇动100次PBS，降低PBS。 重复此操作一次。 7 .取出胰酶瓶，用烧瓶口和镊子的镊子取下栓子，烧瓶口(至少10转)。 8 .吸管吸入1ml胰酶，打入培养瓶，烧瓶口和盖子培养，盖上盖子9 .拿出桌子外，用倒立显微镜观察细胞，用酒精棉球擦拭瓶口和瓶身，放入培养箱5分钟后取出10 .用倒置显微镜观察细胞的消化状况。 细胞变成单一的圆形，就可以继承。12、11 .请拿到桌子上，烧瓶口，取下盖子，烧瓶口。用吸管吸胰酶，烤瓶口。 12 .取出培养基瓶，用烧瓶口和镊子的镊子取下栓子，烧瓶口(至少10转)。 13 .用吸管吸取5ml的培养基，打入培养瓶，用吸管制成各个细胞悬浊液。 14 .用吸管将细胞悬液移至5ml离心管，盖上盖子，在离心分离机内离心，转速1500转/分钟，时间15分钟。 15 .离心结束后，拿到桌子内，烤离心喷嘴。 拔掉塞子，烤喷嘴。 丢弃上清液，喷洒2ml冷冻保存液，将细胞均匀混入冷冻保存液中，再加入3ml冷冻保存液，用吸管吸入多个冷冻保存管中，每管1.5ml。 17 .盖上盖子，用封口膜密封，并附上细胞名称和日期。 18 .冷冻保存方式： 430分钟、-2015分钟、-8060分钟，最后转移到液氮浴中。 注意：冷冻保管请夹在冰块之间移动。 取出、14、复苏、1 .开放瓶，加入蒸馏水，放入电恒温水槽，温度设定为39.0。 达到2.39.030分钟后，用镊子将要恢复的细胞从液氮管中取出，迅速放入开放瓶中，摇晃使冷冻保管内完全液化。 3 .用酒精擦拭冷冻保管管，放入桌子内。 4 .用镊子夹住封口膜，轻轻烘干喷嘴5 .用吸管吸引冷冻保存管内的细胞悬浊液，将新鲜培养基打入装有5ml的培养瓶中。 15、6 .将瓶口、镊子和盖子盖上，用倒立显微镜观察。 7 .请用酒精棉球擦拭瓶口和瓶体，放入培育箱。 注意：在步骤2中，为了防止蒸馏水冻结喷嘴，所有步骤结束后24小时后必须更换液体，16，MTT法，1 .实验开始前，96节流孔必须在超纯台紫外光下照射2小时以上。 2 .从培养箱中取出培养瓶，观察，加入PBS，加入胰酶，消化，加入培养基，计数。 (方法和程序与继承代1-13步相同。 3 .加入培养基，将细胞浓度调整为10000个/200l.4。 除96孔外，每板6行8列48孔，每孔200l.5.96孔盖，取出工作台，用倒立显微镜观察，显示名称、编号和日期。 用酒精棉球擦木板，放入培育箱中培养24小时。 7 .从培养箱中取出，在镜子下观察，拿到桌子内，用200l的枪吸出孔内的培养基8 .加入不同浓度药物的无血清培养基，每孔200l。 9.96打开孔盖，取出桌子，用倒立显微镜观察，用酒精棉球擦拭板，放入培育箱中培养24小时。 10 .从培育箱中取出，在镜子下观察，拿到工作台内，每孔加入20 l MTT液。 盖上、18、11.96孔板盖，取出工作台，用倒立显微镜观察，用酒精棉球擦拭板，放入培育箱中培养4小时。 取出12.96节流孔，将孔内的液体倒掉，在每个孔中放入DMSO150l，放入酶测量仪，隔600秒进行读取即可。 注意：本实验以CHL细胞为例加入DMSO时，应戴口罩和手套。 放入酶测量仪器时，96节流孔不得盖。 反复多次。19、溶液的制备、PBSRPMI1640培养基消化液冻存液MTT的其他溶液、20、PBS制备，然后加入三蒸水1000ml，调整PH在7.2-7.4之间，高压121、30分钟、4预备。21、RPMI1640培养基的制备：取出小袋1640培养粉，加入高压的三蒸水800ml，在1000ml烧杯中加入用玻璃棒搅拌溶解的碳酸氢钠2.0g，再加入三蒸水，定容在1000ml的青霉素(100U/ml )、链霉素烧杯里加入太多酸，用紫外线照射30分钟以上。22、消化液的制备、取0.5克胰蛋白酶粉末，溶解于200 ml PBS缓冲液中，混合，PH调整至7.2，过滤除菌，用1.5ml的EP管分注，在-20冷冻保存。 在培养的无污染培养基中逐渐放入培养。23、冷冻保存液的制备、高压化二甲基亚砜DMSO、胎牛血清和无血清培养基按1:3:6的比例制备。 例如，制备10ml冻存液：在高压小瓶中加入过滤的胎牛血清3ml，加入培养基6ml，最后加入DMSO1ml，混合即可。 24、洗涤液的制备，25、一般使用以下强液。新调制的洗涤液为棕红色，多次使用后，变成绿色时不能使用，需要重新调制。 注意：保护自己，先把重铬酸钾完全溶解在水中(必要时加热帮助溶解)，然后慢慢加入浓硫酸，防止热量过多而使容器破裂。26、噻唑蓝MTT液的制备，方法取25mgMTT，加入5mlPBS液混合，制成5 mg/ml MTT液的原理活细胞线粒体乳酸脱氢酶分解MTT (黄绿色)，产生蓝紫色晶状蛋氨酸粒子，在细胞内和细胞周围注意MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 、27、其他溶液的制备、95%到75%的酒精的制备比例为4:1，例如可以加入75%的酒精20ml、95%的酒精20ml、三蒸水20ml。 从36%-38%的浓度HCL到5%的稀HCL的调制比例为3:17，例如调制1000ml的稀盐酸，在150ml的浓度HCL中加入850ml的蒸馏水即可。28、细胞计数、方法稍微吸入细胞悬浊液，滴入盖片边缘，盖片与计数板之间充满悬浊液。 静置3分钟在镜子下观察，计算板的四大格细胞的总数。 公式是，在细胞数/ml=四大格细胞总数/4104个注意镜下可以看到由两个以上细胞构成的细胞团，如果应用单一细胞计算的细胞团数占10%以上，则重新调制细胞悬浊液。 计数时，不应该测量左和上的压线细胞，在本方格内测量右和下的压线细胞。 29、血清灭活、将血清放入56的水浴锅中完全溶解后开始计时，30分钟后分成20ml的瓶子，在-20待机。 30、实验用品清洗、橡胶、塑料用品玻璃器、31、橡胶、塑料用品用自来水清洗后，放入专用烧杯，加入蒸馏水，将物品稍稍浸泡，放入电炉加热开水时开始记住，三十