第五章-工业微生物诱变育种诱变剂.ppt

第五章工业微生物诱变育种诱变剂,CompanyLogo,本章内容,微生物育种诱变剂,微生物的诱变育种,CompanyLogo,诱变剂是指那些能诱发基因突变、并使突变率提高到超过自发突变水平的物理或化学因子。物理诱变剂种类化学诱变剂生物诱变剂,第一节微生物育种诱变剂,CompanyLogo,CompanyLogo,诱变育种的特点,（1）提高突变率、扩大突变谱。（2）改良单一性状比较有效，同时改良多个性状较困难.（3）性状稳定快，育种年限短。（4）诱发突变的方向和性质尚难掌握。,CompanyLogo,一、物理诱变剂,包括紫外光、x射线、射线、快中子、射线、射线和超声波等。其中紫外光沿用最广，诱变抗生素高产突变株有很优异的效果。非电离辐射：电子级能提高，但不产生离子。电离辐射:能击中电子并产生正离子,物理诱变主要是由于高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。常可以分为物理、物理-化学、化学、生物学阶段(p35)。,CompanyLogo,（一）物理诱变剂的生物学效应,直接作用,间接作用,击中DNA或其它生物结构引起的能量吸收,环境中其它分子,激发和电离分子,激发和电离分子,重排,重排,原初损伤,扩散自由基,分子的变化,代谢,代谢,突变,突变体,生物变化,细胞死亡,物理,物理-化学,化学,生物学,CompanyLogo,1、物理阶段持续时间极短（10-510-8秒）。电离辐射产生能量转移，在体内形成电离效应。2、化学阶段持续时间极短（10-510-8秒）。形成大量的自由基。3、生物化学阶段持续时间短（1010-2秒）。大量的自由基与生物大分子发生化学反应，形成大量的烷化自由基(R.)，将辐射效应转移到生物大分子中。烷化自由基持续时间长，并可通过繁殖传递。,CompanyLogo,4、生物学阶段,持续时间长（甚至几个世代）,并可通过繁殖传递。烷化自由基(R.)与生物大分子发生一系列反应，引起生理和遗传损伤。4.1形态方面的表现损伤：造成死亡，死亡率与辐射剂量成正比生长：抑制生长等，与辐射剂量成正比形态变异：菌落（体）、色泽大小变化。生理变异：不能遗传，逐渐消失。遗传变异：能遗传,CompanyLogo,4.2生理方面的表现,生理方面的表现酶活性的变化POD（过氧化物酶）、SOD、CAT（过氧化氢酶）、核酸酶相关物质含量的变化蛋白质、氨基酸、核苷酸生长素、ABA（天然脱落酸）,CompanyLogo,4.3遗传方面的表现,细胞核方面的表现:细胞核扩大、松散（膨松puffing）微核细胞，微核细胞率与辐射剂量成正比微核细胞率是评价遗传损伤的指标染色体方面的表现:断裂，形成染色体断片、环、桥等。染色体畸变率与辐射剂量成正比染色体畸变率是评价遗传损伤的指标,CompanyLogo,DNA方面的表现:DNA断裂、分解，形成单链结构DNA非按时合成存在自我损伤修复机制，提前进行DNA合成，进行DNA损伤修复生长素类物质促进DNA损伤修复咖啡因、EDTA等拟制DNA损伤修复,CompanyLogo,菌种的遗传背景和生理状态；可见光；水分；电离辐射诱变剂在氧气或空气中使用时，其辐射效应一般要比在真空中或在惰性气体中时要高；温度对电离辐射效应也有影响，主要是能改变氧与自由基，或自由基相互间的作用程度。,（二）影响辐射效应的因子,CompanyLogo,1、性质和来源波长在40一390nm之间。由于DNA分子的紫外光吸收值为260nm，因而波长在200-300nm的紫外光才有诱变作用。紫外光源一般要求为发射光谱集中在260nm附近的紫外光灯，灯管内装有氖气的低压放电灯是较理想的光源，国内一般采用30瓦的紫外光灯，光谱分布范围广，诱变效率差。特点：能量较低；对组织穿透力强.,（三）非电离辐射紫外线,CompanyLogo,2、紫外光的剂量,单位:尔格能量/mm2(灯具发射强度随使用时间延长而下降。)实际应用-相对剂量：照射时间、杀菌率来表示杀菌率：90.0%-99.9%时间：芽孢菌10min；小芽孢杆菌营养缺陷型1-3min；一般营养体3-5min；无芽孢菌和革兰氏阳性菌0.5-2min。,CompanyLogo,3、诱变机理,嘧啶二聚体DNA链的断裂胞嘧啶与尿嘧啶的水和作用DNA与蛋白质交联,CompanyLogo,CompanyLogo,出发菌株前培养；培养基丰富营养、细菌培养到对数期、真菌孢子刚成熟；制备菌悬液：处理液均用生理盐水制备。细菌调节菌液浓度到108个/ml，真菌约为106107/ml，放线菌则为l07108/ml.,4、操作方法,CompanyLogo,照射设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室、培养皿等;紫外灯：波长为253.7nm,功率是15W;处理时的照射距离：20cm30cm;样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm,照射时，要用磁力搅拌器搅拌。注意：操作和培养时必需避免可见光直射液面，最好在黄色或红色灯光下操作。后培养：1.5-2小时；稀释涂皿,CompanyLogo,（四）、电离辐射,CompanyLogo,（五）新型诱变剂,微波:电磁波红外线：0.751000m激光：光量子流高能电子流：强电离辐射航天育种：利用返回式卫星进行农作物新品种的选育的一种方法。,航椒1号,航茄2号,航天葫芦,CompanyLogo,6、低能离子注入,过程：能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换时间：10191013s中间时发生。特征：具有Y射线能量沉积引起机体损伤的；动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、重排或基因的缺失；慢化离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。,CompanyLogo,常用离子：通常采用N+、H+、Ar。生物学效应：相当于物理和化学诱变两者相结合的复合诱变效应,CompanyLogo,化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。碱基类似物烷化剂移码突变剂其他类,二、化学诱变剂,种类,CompanyLogo,1、种类,胸腺嘧啶的结构类似物,（一）碱基类似物,常用,CompanyLogo,腺嘌呤的结构类似物,常用,CompanyLogo,鸟嘌呤的结构类似物,CompanyLogo,2、碱基类似物作用机制,5-溴尿嘧啶（5-BU）是胸腺嘧啶的结构类似物也是一种强诱变剂。它渗入到DNA中，会发生酮式和烯醇式互变，不仅和原来的碱基配对而且和其它碱基配对。,CompanyLogo,例5-BU诱发A-T变为G-C过程,掺入到DNA的复制过程，碱基类似物又成为掺入诱变剂,CompanyLogo,3、各种碱基类似物的性质和使用方法性质5-溴(氟)尿嘧啶(5-Bu，或5-Fu)为白色无味结晶粉末，溶于水或醇中，几乎不溶于氯仿和乙醚。脱氧溴尿核苷(亦即溴脱氧尿核苷，5-BudR)，白色结晶状粉末，无臭、无味，难溶于水和甲醇，易溶于碱性溶液。6-巯基嘌呤(6MP)为黄色无臭结晶粉末，熔点313-314(当即分解)，在空气中或见光会发黑变质，溶于乙醇，碱性溶液和稀硫酸，几乎不溶于水、丙酮、氯仿和醚。,CompanyLogo,使用方法1）将待处理的细菌于液体培养基中培养到对数期，离心去培养液。2）饥饿培养：生理盐水8-10小时3)把5-Bu或5-Fu（一般剂量为5-300gml，细菌25-40gml）加到培养基中，做平板。4）涂皿菌体涂布在含一定浓度的碱基类似物的培养基平皿上，适温培养，挑取菌落筛选。,CompanyLogo,(二)烷化剂,烷化剂是一种常见的诱变剂，这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，他们容易取代DNA分子中的活泼氢原子，直接和一个或多个碱基起烷化反应。,85,CompanyLogo,1）单功能烷化剂：有一个烷化基团，对生物毒性小诱变效应大。2）双功能或多功能烷化剂：有两个或多个烷化基团对生物毒性大，诱变效应小。,1、烷化剂种类,CompanyLogo,CH3SO2OCH3SO2(OC2H5)2:硫酸二乙酯DMS,CompanyLogo,2、烷化剂作用机理,EMS引起碱基转换,CompanyLogo,一般认为甲基化比乙基化造成能造成更多的断裂和缺失，所以MMS的毒性大于EMS。,烷化剂,CompanyLogo,3、常用烷化剂及其使用方法,亚硝基胍（NG、NTG）黄色结晶、性质不稳定，遇光分解。是一种特别强的诱变剂，有超诱变剂的称号。还能诱发邻近的基因同时发生突变，即并发突变。且易诱发复制叉附近并发突变。有微弱移码作用,适于诱变营养缺陷型突变株(10%营养缺陷型)。,CompanyLogo,NTG在水溶液中随着不同pH将产生不同的分解物，从而影响诱变效用.当溶液pH低于5.5时，NTG分解成亚硝酸；当溶液pH在8.0以上时，NTG会分解产生重氮甲烷，对核酸其烷化作用；当溶液pH6.0时，NTG本身DNA其烷化反应而导致突变。,CompanyLogo,a、根据处理菌体特性，选用一定范围pH值的缓冲液制备菌体或孢子悬液。再离心洗涤，除去培养液，然后用缓冲液制备孢子液。b、NG试剂要保存在冰箱内，使用时要特别注意安全操作要在通风柜内，带上橡皮手套，穿上工作服，也不得将NG直接放在纸上暴露称量。最好先准备一只灭菌小瓶，在通风柜中用小勺取15-30mg放入小瓶中称重(现用现配)。NG难溶于水，可按10mg/1ml的比例加入丙酮溶解，再用缓冲液稀释。,NG使用注意事项,CompanyLogo,c、取0.2mlNG处理液与2ml孢子液混合，在一定温度下处理n分钟;d、用缓冲液或生理食盐水大量稀释或多次离心洗涤处理后的混合液并稀释到合适浓度，涂布平皿，分离培养。f、所有接触过NG的器皿均须用l-2N的NaOH液解毒处理。要浸泡过夜并在阳光下晒。最好将接触稀浓不同的NG液的器皿分别作解毒处理。,CompanyLogo,能和DNA分子结合，并造成其碱基对增多或缺失，从而诱发突变的化合物。包括压吖啶类杂环染料以及一些烷化剂和吖啶类相结合的化合物，总称为ICR类化合物。使用方法：用pH7.0磷酸缓冲液将吖啶黄配制成浓度为0.2%溶液，在28振荡34小时使其完全溶解。直接加入孢子液接触处理或加入培养基内。如为生长过程处理，平皿内浓度一般为10-50gml的吖啶黄，处理时避光操作。,(三)移码诱变剂,CompanyLogo,DNA链上的两个碱基插入移码突变剂后，两个碱基之间的距离变大，引起碱基缺失和插入,CompanyLogo,羟胺：专一作用于胞嘧啶，改变了DNA上该碱基的结构，以致在DNA复制过程中，结构改变的胞嘧啶同腺嘌呤而不与鸟嘌呤配对，从而引起了碱基转换G：CA：T。羟胺（NH2OH）（白色晶体，具有腐蚀性）和其它诱变剂相比，只引起G:C转变为A:T,而不引起A:T转变为G:C。,（四）羟胺剂,CompanyLogo,羟胺和细胞内其它物质也能发生作用，生成过氧化氢。过氧化氢是非专一性诱变剂。,对于噬菌体或离体DNA，羟胺是专一性很强的诱变剂，但对细菌、真菌和放线菌等微生物，诱变效果不理想,CompanyLogo,CompanyLogo,（五）脱氨剂-亚硝类诱变剂作用原理,作用：通过氧化脱氨基造成的。胞嘧啶(C)经氧化脱氨后成为尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)经脱氨后成为次黄嘌呤(H)，鸟嘌呤(G)脱氨成为黄嘌呤(X)。,CompanyLogo,CompanyLogo,使用方法不稳定，常用盐类亚硝酸钠1、0.1M亚硝酸钠溶液：称用0.1M醋酸缓冲液配制浓度为0.05M亚硝酸钠溶液。2、挑大肠杆菌一环于5mlLB肉汤中，37培养14-16小时。3500r/min，离心5min。弃上清液，打匀沉淀加5mlpH4.6的醋酸缓冲液，二次离心。弃上清液，加现配的HNO21ml混匀，37保温5min。3、5min后，涂皿（稀释到10-5）。,CompanyLogo,（六）其它化学诱变剂,秋水仙碱诱法细胞染色体加倍。抑制纺锤丝纺锤体的形成，在染色体复制完成后无法移向两极。,CompanyLogo,抗生素作为诱变剂的主要抗生素有放线菌素、争光霉素、链黑霉素。这些抗生素一般都是抗癌药物。它们的诱变作用一般没有烷花剂显著，常和其它诱变剂搭配使用。,金属盐类用于诱变的金属盐类有LiCl、硫酸锰等。其中LiCl比较常用，同其它诱变剂搭配使用效果显著。叠氮化物如叠氮化钠(NaN3)NaN3等电点是pH=4.18,在pH=3时NaN3溶液中主要产生呈中性的分子HN3,易透过膜进入细胞内,以碱基替换方式影响DNA的正常合成,从而导致点突变的产生。NaN3具有高效、无毒、便宜及使用安全等优点。,CompanyLogo,化学诱变剂多数是致癌、极毒药品，在进行诱变、操作后的处置以及诱变剂的保藏等方面的安全防护工作都是极其重要的。如有疏忽，就可能对健康和环境保护带来不良后果，万万不可等闲视之!,（七）化学诱变剂安全操作须,CompanyLogo,根据其本身性质，选择合适的保存条件如：对光敏感的要避光保存，挥发性强的要低温密封，易潮解的要保持干燥进行诱变操作时，尽一切可能使试剂不触及人体任何部位，必要时要有防护用具，绝对不用口吸液体，并尽量按本身性质要求操作(如低温、避光、密闭)(3)诱变处理过程结束后，需对试剂残余进行解毒及稀释处理，避免造成环境污染,要求,CompanyLogo,噬菌体：溶